末梢性TMD疼痛メカニズムとボツリヌス毒素Aによる効果

患者募集:

患者は、University Dental Clinic、Karolinska Institutet、Huddinge、Sweden の口腔顔面痛および顎機能の専門クリニックに紹介された患者の中から、または広告を介して募集されます。

ランダム化:

患者は、ランダムジェネレーター (www.randomization.com) によって無作為に治療に割り当てられます。 参加者ごとに、データ収集の他の部分に関与していない研究者によって、治療がメモに書かれ、封印された封筒に入れられます。 患者の検査に関与していない別の人が封筒を開け、無作為化された溶液で注射器を準備し、検査者と患者が入る前に検査室に置きます。 ボツリヌス毒素と生理食塩水は外観が同じであるため、参加者と研究者は治療の割り当てに対してマスクされます。

手順：

参加者は、最初の訪問の前に、TMD の診断基準 (DC/TMD) に含まれるスウェーデンの Axis II アンケートの拡張版とわずかに修正されたバージョンを完成させます。 Axis II アンケートには、社会人口学的質問、診断目的で使用される TMD の症状と頭痛 (存在、期間、頻度) に関する質問 (症状アンケート)、および身体的および感情的機能を評価するための検証済みの手段が含まれています。 次に、DC/TMD 軸 I に従って臨床検査を行います。この軸 I には、圧痛閾値、一時的合計痛、および条件付き疼痛調節の記録も含まれます。 参加者が適格な基準を満たしていることを確認した後、後で分析するために、痛みを伴う部位と痛みのない部位から生検を取得します。 少なくとも 1 週間後、治療が行われます。

生検:

マイクロバイオプシーは、咬筋および前脛骨筋から取得されます (未処理の痛みのない内部コントロール)。 マイクロバイオプシーは、皮膚表面麻酔下で筋肉の最も顕著な部分を覆う皮膚を通して採取されます。 穿刺深さ 11 mm、直径 18 ゴーシュ (G) (咬筋) または 16G (脛骨筋) の使い捨て生検器具を使用します。 生検器具は、10 mm の深さまで挿入される同軸針で誘導されます。 十分な筋肉組織が得られるように、各筋肉から 3 ～ 4 回のマイクロバイオプシーを行います。 筋膜が貫通するまで同軸針を筋肉の長軸に沿って挿入し、生検器具を同軸針を通して挿入し、約 0.12 cm * 1.1 cm のサイズの筋肉片を収集します。 筋切片は滅菌プローブを使用して生検器具から取り除かれ、すぐに液体窒素で急速凍結されたクリオチューブに入れられます。 筋肉切片を取り除いた後、生検器具を等張食塩水ですすぐ。 この手順を 2 ～ 3 回繰り返します。 マイクロバイオプシーが筋肉の新しい部分から採取されるように、生検器具が45°回転するたびに。 生検は、分析までカロリンスカ研究所の歯科バイオバンクに保存されます (-80º)。

生検の分析:

生検は、バルク リボ核酸シーケンシング (RNA-seq)、Multiome (トランスポザーゼ アクセス可能クロマチン (ATAC) および RNA-seq の単一細胞アッセイの組み合わせ)、免疫組織化学 (IHC)、ライト シート顕微鏡法、およびフローサイトメトリー ( FC) は、サンアントニオのテキサス大学健康科学センター (UTHSCSA) とスウェーデンのハディンゲにあるカロリンスカ研究所の生細胞イメージング施設で行われました。 痛みのない部位（前脛骨筋）のデータは、すべての患者の痛みのある部位（咬筋）のデータから差し引かれます。 次に、これらのデータをクラスター化できます。

バルク RNA シーケンスの場合、差次的に発現する遺伝子 (DEG) が選択され、R (edgeR) ソフトウェアでの DEG の経験的分析内でペア分析が実行され、有意に異なる (p<0.05) が選択されます。 度。 これは確立され、十分に標準化されたアプローチです。 さらに分析するための選択基準は、倍電荷 (FC) > 1.5 およびマッピングされた 100 万回の読み取りあたりの転写物のキロベースあたりの読み取り (RPKM) > 10 です。 最後に、生物学的プロセスは、DEG に基づいて www.pantherdb.org によって定義されます。 実験データからの内部コントロールのサブステーションも行われ、その後、DEG を使用した患者のクラスタリングが行われます。 どちらのアプローチでも同様の結果が得られます。 皮膚生検の予備結果に基づく検出力分析では、19 の対のサンプルが 0.8 の標準偏差 (SD) で 83.6% の検出力を得ることが示されました。 ただし、筋肉組織からの RNA は通常、皮膚サンプルよりも高品質です。 したがって、研究者は、バルク RNA-seq の SD が少なくなり、グループごとに 14 対のサンプルが必要になると予想しています。これには、処理後のサンプルが含まれます。

細胞レベルでの遺伝子とエピジェネティックな署名の可塑性の組み合わせは、Genomic x10 プラットフォームを使用して Multiome によって評価されます。 Multiome 解析は、Genomic x10 によって標準化されています。 ビジュアル プレゼンテーションにはスーラが使用されます。 Multiome の検出力分析では、グループごとに 3 ～ 4 対のサンプルが必要であることが示されました。 現在受け入れられている分析は、同じ参加者グループに属するペアのサンプルを組み合わせ、各細胞クラスターの複数の t 検定のような分析を別のグループに対して実行することです。

IHC 分析では、感覚ニューロンのサブセットのマーカーを使用して感覚神経突起の可塑性に焦点を当て、ライト シート顕微鏡を使用して生検全体の神経突起の長さと分岐を測定します。 研究者はまた、いくつかの種とサブクラスから免疫グロブリン G の安定した均一な抗体コンジュゲートを生成する Glyclick メソッドを使用することを計画しています。 可能であれば、プロテオミクスも行います。 FC は、免疫細胞および血管系細胞のプロファイリングに使用されます。 検出力分析により、IHC および FC にはグループごとに 8 つのサンプルが必要になることが示されました。

臨床データの分析:

P<0.05 が有意水準として使用されます。 Shapiro-Wilk の検定は、データの正規性を検定します。 正規性に応じて、平均 (SD) または中央値 (四分位範囲、IQR) を使用してデータを記述します。 正規分布および連続データの反復測定の場合、分散分析 (ANOVA) を使用して、因子としてのグループおよび時間を使用した治療効果の違いを分析します。 有意差が見つかった場合、これらは Dunnet の事後検定でさらに分析されます。 ゆがんだデータまたは順序付けられたデータは、時間差の事後検定としてダンの検定を使用して、グループごとにフリードマン ANOVA で個別に分析されます。 マン・ホイットニーの U 検定を使用して、複数のテストにボンフェローニ補正を使用して、異なる時点でのグループ間の違いを分析します。

多変量統計を使用して、大幅に変化したバイオマーカーと他の変数との相関関係を特定します。 主成分分析 (PCA) を使用して、中程度または強い外れ値を特定します。 次に、直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) を使用して、バイオマーカーをリグレッサーとして使用してグループ メンバーシップを回帰します。 バイオマーカーと臨床変数の間の相関関係については、OPLS モデリングが実行されます。 投影に対する変数の影響 (VIP) の値は、すべての次元にわたってプールされた各 X 変数の関連性を示し、Y 変数は、Y を最もよく説明する変数のグループを示します。VIP > 1.0 は有意と見なされます。 R2 は適合度、つまり主成分によって説明されるすべての変数の平方和の割合を表し、Q2 は予測の良さ、つまり主成分によって予測できる変数の総変動の割合を表します。交差検証方法を使用するコンポーネント。 R2 が Q2 より大幅に高くなることはありません。大幅に高い (>0.3) モデルのロバスト性が低い場合です。 モデルを検証するために、得られた交差検証分散分析 (CV-ANOVA) p 値が使用されます。 CV-ANOVA の p 値が 0.05 未満の場合、OPLS-DA モデルは非常に重要であると見なされます。