말초 TMD 통증 기전과 Botulinum Toxin A의 효과

환자 모집:

환자들은 스웨덴 후딩에 소재 카롤린스카 인스티튜트 대학 치과 클리닉의 구강안면 통증 및 턱 기능 전문 클리닉에 소개되거나 광고를 통해 모집될 것입니다.

무작위화:

환자는 무작위 생성기(www.randomization.com)에 의해 치료에 무작위로 배정됩니다. 각 참가자에 대한 처리는 데이터 수집의 다른 부분에 관여하지 않는 연구원이 메모에 작성하고 밀봉된 봉투에 넣습니다. 환자 진찰에 관여하지 않는 2인자가 봉투를 개봉하여 무작위 용액이 담긴 주사기를 준비하고 진찰관과 환자가 들어가기 전에 진찰실에 둔다. 보툴리눔 독소와 식염수는 모양이 동일하므로 참가자와 조사자는 치료 할당에 가려집니다.

절차:

참가자는 첫 번째 방문 전에 TMD 진단 기준(DC/TMD)에 포함된 Swedish Axis II 설문지의 확장되고 약간 수정된 버전을 작성합니다. Axis II 설문지는 사회인구학적 질문, TMD 증상 및 두통에 관한 질문(존재, 지속 기간 및 빈도)을 포함하며 진단 목적(증상 질문지) 및 신체 및 정서적 기능을 평가하기 위해 검증된 도구를 사용합니다. 그런 다음 욕창 역치, 시간적 합산 통증 및 조건화된 통증 조절의 기록을 포함하는 DC/TMD 축 I에 따라 임상 검사가 수행됩니다. 참가자가 적격 기준을 충족하는지 확인한 후 추후 분석을 위해 통증이 있는 부위와 통증이 없는 부위에서 생검을 얻습니다. 이후 최소 1주일 후에 치료를 받습니다.

생검:

교근 및 전경골근(무통증 내부 대조군)에서 미생물검을 채취합니다. 미생물 검사는 피부 표면 마취하에 근육의 가장 눈에 띄는 부분을 덮는 피부를 통해 이루어집니다. 침투 깊이가 11mm이고 직경이 18g(교근) 또는 16G(경골)인 일회용 생검 기구가 사용됩니다. 생검 기구는 10mm 깊이로 삽입될 동축 바늘로 유도됩니다. 충분한 근육 조직을 확보하기 위해 각 근육에서 3~4개의 미생물 검사를 실시합니다. 근막을 관통할 때까지 동축 바늘을 근육의 장축을 따라 삽입한 후 동축 바늘을 통해 생검 기구를 삽입하고 약 0.12 cm * 1.1 cm 크기의 근육 조각을 채취합니다. 멸균 프로브를 사용하여 생검 기구에서 근육 절편을 제거하고 즉시 액체 질소에 급속 동결된 저온 튜브에 넣습니다. 근육 절편을 제거한 후 생검 기구를 등장 식염수로 헹굽니다. 이 과정을 2~3회 반복하게 됩니다. 미생물 검사가 근육의 새로운 부분에서 취해질 수 있도록 생검 기구가 45° 회전될 때마다. 생검은 분석할 때까지 Karolinska Institutet의 치과 바이오뱅크에 저장됩니다(-80º).

생검 분석:

생검은 벌크 리보핵산 시퀀싱(RNA-seq), Multiome(ATAC(Transposase-Accessible Chromatin) 및 RNA-seq에 대한 결합된 단일 세포 분석), 면역조직화학(IHC), 광시트 현미경 및 유세포분석( FC) 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 건강 과학 센터(UTHSCSA) 및 스웨덴 후딩에 카롤린스카 연구소의 라이브 셀 이미징 시설에서. 통증이 없는 부위(앞경골근)의 데이터는 모든 환자의 통증 부위(교근) 데이터에서 뺍니다. 그런 다음 이러한 데이터를 클러스터링할 수 있습니다.

벌크 RNA seq의 경우, 차별적으로 발현된 유전자(DEG)를 선택한 다음 R(edgeR) 소프트웨어에서 DEG의 경험적 분석 내에서 쌍 분석을 실행하여 상당히 다른(p<0.05) 선택합니다. DEG. 이것은 확립되고 잘 표준화된 접근 방식입니다. 추가 분석을 위한 선택 기준은 폴드 차지(FC)>1.5 및 RPKM(백만 매핑된 읽기당 전사체의 킬로베이스당 읽기)>10입니다. 마지막으로 생물학적 과정은 DEG를 기반으로 www.pantherdb.org에 의해 정의됩니다. 실험 데이터에서 내부 통제를 대체한 다음 DEG를 사용하여 환자를 클러스터링합니다. 두 접근 방식 모두 유사한 결과를 생성합니다. 피부 생검의 예비 결과를 기반으로 한 검정력 분석은 19쌍의 샘플이 0.8의 표준 편차(SD)로 83.6%의 검정력을 얻는 것으로 나타났습니다. 그러나 근육 조직의 RNA는 일반적으로 피부 샘플보다 품질이 높습니다. 따라서 조사관은 벌크 RNA-seq가 SD가 더 낮고 그룹당 14쌍의 샘플이 필요할 것으로 예상합니다. 여기에는 처리 후 샘플이 포함됩니다.

Multiome은 Genomic x10 플랫폼을 사용하여 세포 수준에서 결합된 유전자 및 후생유전학적 서명 가소성을 평가합니다. Multiome 분석은 Genomic x10으로 표준화되었습니다. 시각적 프레젠테이션을 위해 Seurat가 사용됩니다. Multiome에 대한 검정력 분석은 그룹당 3-4개의 짝을 이룬 샘플이 필요하다는 것을 보여주었습니다. 현재 허용되는 분석은 동일한 참가자 그룹에 속하는 쌍을 이룬 샘플이 결합되고 각 셀 클러스터에 대한 다중 t-테스트 유사 분석이 다른 그룹에 대해 실행된다는 것입니다.

IHC 분석은 감각 뉴런의 하위 집합에 대한 마커를 사용하여 감각 신경 돌기 가소성에 초점을 맞추고 라이트 시트 현미경을 사용하여 전체 생검에 대한 신경 돌기 길이 및 분기를 측정합니다. 연구자들은 또한 여러 종 및 하위 클래스로부터 면역글로빈 G에 대한 안정하고 균일한 항체 접합체를 생성하는 Glyclick 방법을 사용할 계획입니다. 가능하면 프로테오믹스도 수행됩니다. FC는 면역 및 혈관계 세포를 프로파일링하는 데 사용됩니다. 전력 분석은 그룹당 8개의 샘플이 IHC 및 FC에 필요할 것임을 보여주었습니다.

임상 데이터 분석:

P<0.05가 유의 수준으로 사용됩니다. Shapiro-Wilk의 테스트는 데이터의 정규성을 테스트합니다. 정규성에 따라 평균(SD) 또는 중앙값(사분위수 범위, IQR)이 데이터를 설명하는 데 사용됩니다. 정규 분포 및 연속 데이터의 경우 반복 측정 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 및 시간을 요인으로 하여 치료 효과의 차이를 분석합니다. 유의미한 차이가 발견되면 Dunnet의 사후 테스트로 추가 분석됩니다. 왜곡되거나 순서가 있는 데이터는 시간 차이에 대한 사후 테스트로 Dunn의 테스트를 사용하여 개별적으로 각 그룹에 대해 Friedman ANOVA로 분석됩니다. Mann-Whitney U-테스트는 여러 테스트에 대해 Bonferroni 보정을 사용하여 서로 다른 시점에서 그룹 간의 차이를 분석하는 데 사용됩니다.

크게 변경된 바이오마커와 기타 변수 사이의 상관관계를 식별하기 위해 다변량 통계가 사용됩니다. 주성분 분석(PCA)을 사용하여 보통 이상값 또는 강력한 이상값을 식별합니다. 그런 다음 직교 부분 최소 자승 판별 분석(OPLS-DA)을 사용하여 바이오마커를 회귀자로 사용하여 그룹 구성원을 회귀시킵니다. 바이오마커와 임상 변수 간의 상관관계를 위해 OPLS 모델링이 수행됩니다. VIP(Projection에 대한 변수 영향) 값은 모든 차원에 대해 풀링된 각 X-변수의 관련성을 나타내고 Y-변수는 Y를 가장 잘 설명하는 변수 그룹을 나타냅니다. VIP > 1.0은 유의한 것으로 간주됩니다. R2는 적합도, 즉 주성분에 의해 설명되는 모든 변수의 제곱합의 비율을 설명하고 Q2는 예측의 양호도, 즉 주성분에 의해 예측될 수 있는 변수의 전체 변동의 비율을 설명합니다. 교차 유효성 검사 방법을 사용하는 구성 요소. R2는 Q2보다 상당히 높지 않아야 합니다. 상당히 높으면(>0.3) 모델의 견고성이 좋지 않은 것입니다. 모델을 검증하기 위해 얻은 CV-ANOVA(교차 검증 분산 분석) p-값이 사용됩니다. CV-ANOVA의 p-값이 0.05 미만인 경우 OPLS-DA 모델이 매우 중요한 것으로 간주됩니다.