Meccanismi periferici del dolore TMD ed effetto della tossina botulinica A

Reclutamento dei pazienti:

I pazienti saranno reclutati tra quelli indirizzati alla Clinica specialistica per il dolore orofacciale e la funzione mascellare presso la Clinica odontoiatrica universitaria, Karolinska Institutet, Huddinge, Svezia, o tramite pubblicità.

Randomizzazione:

I pazienti verranno assegnati in modo casuale al trattamento da un generatore casuale (www.randomization.com). Per ogni partecipante il trattamento verrà scritto su una nota e inserito in una busta sigillata da un ricercatore non coinvolto in nessun'altra parte della raccolta dei dati. Una seconda persona non coinvolta nell'esame del paziente aprirà la busta, preparerà la siringa con la soluzione randomizzata e la posizionerà nella sala d'esame prima che l'esaminatore e il paziente vi entrino. La tossina botulinica e la soluzione salina hanno un aspetto identico, quindi il partecipante e lo sperimentatore saranno mascherati all'assegnazione del trattamento.

Procedura:

I partecipanti completano una versione estesa e leggermente modificata del questionario dell'Asse II svedese incluso nei Criteri diagnostici per TMD (DC/TMD) prima della prima visita. Il questionario di Asse II contiene domande sociodemografiche, domande relative ai sintomi TMD e alla cefalea (presenza, durata e frequenza) utilizzate a fini diagnostici (Symptom Questionnaire) e strumenti validati per valutare la funzione fisica ed emotiva. Viene quindi eseguito un esame clinico secondo l'Asse I DC/TMD che comprende anche le registrazioni della soglia del dolore alla pressione, del dolore della sommatoria temporale e della modulazione del dolore condizionato. Dopo essersi assicurati che il partecipante soddisfi i criteri ammissibili, le biopsie vengono ottenute da un sito doloroso e non doloroso per un'analisi successiva. Almeno una settimana dopo il trattamento viene somministrato.

Biopsie:

Microbiopsie saranno ottenute dal muscolo massetere e tibiale anteriore (un controllo interno indolore non trattato). Le microbiopsie vengono prelevate attraverso la pelle che ricopre la parte più prominente del muscolo sotto anestesia superficiale della pelle. Verrà utilizzato uno strumento per biopsia monouso con una profondità di penetrazione di 11 mm e un diametro di 18 gauche (G) (massetere) o 16G (tibiale). Lo strumento per la biopsia sarà guidato con un ago coassiale, che verrà inserito a una profondità di 10 mm. Verranno prelevate da tre a quattro microbiopsie da ciascun muscolo per garantire l'ottenimento di tessuto muscolare sufficiente. L'ago coassiale verrà inserito lungo l'asse lungo dei muscoli fino a quando la fascia non viene penetrata e lo strumento per biopsia viene quindi inserito attraverso l'ago coassiale e viene raccolto un pezzo di muscolo con una dimensione di circa 0,12 cm * 1,1 cm. La sezione muscolare verrà rimossa dallo strumento per biopsia utilizzando una sonda sterile e immediatamente inserita in un criotubo che viene congelato a scatto in azoto liquido. Dopo la rimozione della sezione muscolare, lo strumento bioptico sarà risciacquato con soluzione fisiologica isotonica. Questa procedura verrà ripetuta due o tre volte. Ogni volta lo strumento per la biopsia verrà ruotato di 45° in modo che la microbiopsia venga prelevata da una nuova porzione del muscolo. Le biopsie saranno conservate (-80º) nella biobanca dentale del Karolinska Institutet fino all'analisi.

Analisi delle biopsie:

Le biopsie saranno analizzate con sequenziamento dell'acido ribonucleico di massa (RNA-seq), Multiome (saggio combinato a singola cellula per trasposasi-accessibile cromatina (ATAC) e RNA-seq), immunoistochimica (IHC), microscopia a foglio leggero e citometria a flusso ( FC) presso l'Health Science Center dell'Università del Texas a San Antonio (UTHSCSA) e presso il Live Cell Imaging Facility del Karolinska Institutet, Huddinge, Svezia. I dati della sede non dolente (tibiale anteriore) saranno sottratti dai dati della sede dolente (massetere) per ogni paziente. Quindi, questi dati possono essere raggruppati.

Per l'RNA seq di massa, verranno selezionati i geni espressi in modo differenziale (DEG) e quindi verrà eseguita un'analisi accoppiata all'interno dell'analisi empirica dei DEG nel software R (edgeR) per selezionare significativamente diversi (p <0,05) DEG. Si tratta di un approccio consolidato e ben standardizzato. I criteri di selezione per ulteriori analisi sono la carica di piegatura (FC)> 1,5 e le letture per chilobase di trascrizione per milione di letture mappate (RPKM)> 10. Infine, i processi biologici saranno definiti da www.pantherdb.org sulla base dei DEG. Verrà inoltre eseguita la sottostazione dei controlli interni dai dati sperimentali, seguita dal raggruppamento dei pazienti utilizzando DEG. Entrambi gli approcci producono risultati simili. L'analisi della potenza basata sui risultati preliminari delle biopsie cutanee ha mostrato che 19 campioni accoppiati otterranno l'83,6% di potenza con una deviazione standard (DS) di 0,8. Tuttavia, l'RNA del tessuto muscolare è generalmente di qualità superiore rispetto ai campioni di pelle. Pertanto, i ricercatori prevedono che l'RNA-seq di massa avrà una SD minore e richiederà 14 campioni accoppiati per gruppo; questo include i campioni dopo i trattamenti.

La plasticità combinata del gene e della firma epigenetica a livello cellulare sarà valutata da Multiome utilizzando la piattaforma Genomic x10. L'analisi multioma è standardizzata da Genomic x10. Per la presentazione visiva verrà utilizzato Seurat. L'analisi della potenza per Multiome ha mostrato che sono necessari 3-4 campioni accoppiati per gruppo. L'analisi attualmente accettata prevede che campioni accoppiati appartenenti allo stesso gruppo di partecipanti combinati e analisi multiple simili a test t per ciascun cluster di cellule vengano eseguite contro un altro gruppo.

L'analisi IHC si concentrerà sulla plasticità sensoriale dei neuriti utilizzando marcatori per sottoinsiemi di neuroni sensoriali e utilizzerà la microscopia Light Sheet per misurare la lunghezza e la ramificazione dei neuriti per intere biopsie. I ricercatori prevedono inoltre di utilizzare il metodo Glyclick che genera coniugati anticorpali stabili e omogenei per l'immunoglobina G da diverse specie e sottoclassi. Se possibile, verrà eseguita anche la proteomica. La FC sarà utilizzata per profilare le cellule immunitarie e vascolari. L'analisi della potenza ha mostrato che saranno necessari 8 campioni per gruppo per IHC e FC.

Analisi dei dati clinici:

P<0.05 sarà utilizzato come livello di significatività. Il test di Shapiro-Wilk verificherà la normalità dei dati. Per descrivere i dati verrà utilizzata la media (DS) o la mediana (intervallo interquartile, IQR), a seconda della normalità. Per dati normalmente distribuiti e continui, misure ripetute dell'Analisi della Varianza (ANOVA) saranno utilizzate per analizzare le differenze nell'effetto del trattamento con il Gruppo e il Tempo come fattori. Se si riscontrano differenze significative, queste saranno ulteriormente analizzate con il test posthoc di Dunnet. I dati distorti o ordinali saranno analizzati con Friedman ANOVA per ciascun gruppo separatamente con il test di Dunn come test posthoc per le differenze di tempo. Il Mann-Whitney U-test verrà utilizzato per analizzare le differenze tra i gruppi in diversi punti temporali, utilizzando la correzione di Bonferroni per test multipli.

Verranno utilizzate statistiche multivariate per identificare correlazioni tra biomarcatori significativamente modificati e altre variabili. L'analisi delle componenti principali (PCA) verrà utilizzata per identificare valori anomali moderati o forti. L'analisi discriminante dei minimi quadrati parziali ortogonali (OPLS-DA) verrà quindi utilizzata per regredire l'appartenenza al gruppo utilizzando i biomarcatori come regressori. Per le correlazioni tra biomarcatori e variabili cliniche verrà eseguita la modellazione OPLS. Il valore Variable Influence on Projection (VIP) indica la rilevanza di ciascuna variabile X raggruppata su tutte le dimensioni e le variabili Y indicano il gruppo di variabili che meglio spiegano Y. VIP > 1.0 è considerato significativo. R2 descrive la bontà dell'adattamento, cioè la frazione della somma dei quadrati di tutte le variabili spiegate da una componente principale mentre Q2 descrive la bontà della previsione, cioè la frazione della variazione totale delle variabili che possono essere previste da una componente principale componente utilizzando metodi di convalida incrociata. R2 non dovrebbe essere considerevolmente superiore a Q2, se sostanzialmente superiore (>0,3) la robustezza del modello è scarsa. Per convalidare il modello, verrà utilizzata un'analisi incrociata della varianza (CV-ANOVA) p-value ottenuta. Il modello OPLS-DA è considerato di importanza significativa se il CV-ANOVA ha un valore p <0,05.