Механизмы периферической боли при ДВНЧС и эффект ботулинического токсина А

Набор пациентов:

Пациентов будут набирать среди тех, кто направлен в Специализированную клинику лечения орофациальной боли и функции челюсти при Университетской стоматологической клинике Каролинского института, Худдинге, Швеция, или по рекламе.

Рандомизация:

Пациенты будут случайным образом назначаться для лечения с помощью генератора случайных чисел (www.randomization.com). Для каждого участника лечение будет записано в записке и помещено в запечатанный конверт исследователем, не участвующим в какой-либо другой части сбора данных. Второй человек, не участвующий в обследовании пациента, откроет конверт, подготовит шприц с рандомизированным раствором и поместит его в комнату для осмотра до того, как в нее войдут врач и пациент. Ботулинический токсин и физиологический раствор имеют одинаковый внешний вид, поэтому участник и исследователь будут замаскированы для назначения лечения.

Процедура:

Перед первым посещением участники заполняют расширенную и слегка измененную версию шведского опросника Axis II, включенного в диагностические критерии для ВНЧС (DC/TMD). Опросник оси II содержит социально-демографический вопрос, вопросы о симптомах ДВНЧС и головной боли (наличие, продолжительность и частота), используемые в диагностических целях (опросник симптомов), и утвержденные инструменты для оценки физической и эмоциональной функции. Затем проводится клиническое обследование в соответствии с осью I DC/TMD, которая также включает в себя регистрацию болевого порога при надавливании, боли во временном суммировании и модуляции условной боли. Убедившись, что участник соответствует приемлемым критериям, биопсия берется из болезненного и безболезненного участка для последующего анализа. По крайней мере одну неделю после этого лечения дается.

Биопсия:

Микробиопсии будут получены из жевательной мышцы и передней большеберцовой мышцы (необработанный безболезненный внутренний контроль). Микробиопсии берутся через кожу, покрывающую наиболее выступающую часть мышцы, под кожной поверхностной анестезией. Будет использоваться одноразовый инструмент для биопсии с глубиной проникновения 11 мм и диаметром 18 Gauche (G) (жевательная мышца) или 16G (большеберцовая мышца). Инструмент для биопсии направляется коаксиальной иглой, которая вводится на глубину 10 мм. Из каждой мышцы будет взято три-четыре микробиопсии, чтобы убедиться, что получено достаточное количество мышечной ткани. Коаксиальная игла вводится вдоль длинной оси мышц до тех пор, пока не будет проколота фасция, затем через коаксиальную иглу вводится инструмент для биопсии и берется кусок мышцы размером примерно 0,12 см * 1,1 см. Срез мышцы удаляют из инструмента для биопсии с помощью стерильного зонда и немедленно помещают в криопробирку, которую быстро замораживают в жидком азоте. После удаления участка мышцы инструмент для биопсии промывают изотоническим раствором. Эта процедура повторяется два-три раза. Каждый раз инструмент для биопсии будет поворачиваться на 45°, чтобы микробиопсия бралась из новой части мышцы. Биоптаты будут храниться (-80º) в стоматологическом биобанке Каролинского института до анализа.

Анализы биоптатов:

Биоптаты будут проанализированы с помощью объемного секвенирования рибонуклеиновой кислоты (RNA-seq), Multiome (комбинированный анализ отдельных клеток на транспозазо-доступный хроматин (ATAC) и RNA-seq), иммуногистохимии (IHC), световой микроскопии и проточной цитометрии ( FC) в Центре медицинских наук Техасского университета в Сан-Антонио (UTHSCSA) и в Центре визуализации живых клеток Каролинского института, Худдинге, Швеция. Данные о безболезненном участке (передняя большеберцовая мышца) будут вычтены из данных о болезненном участке (жевательной мышце) для каждого пациента. Затем эти данные можно сгруппировать.

Для массовой последовательности РНК будут выбраны дифференциально экспрессируемые гены (DEG), а затем будет проведен парный анализ в рамках эмпирического анализа DEG в программном обеспечении R (edgeR), чтобы выбрать значительно отличающиеся (p<0,05) ДЭГ. Это устоявшийся и хорошо стандартизированный подход. Критериями отбора для дальнейшего анализа являются кратность заряда (FC) > 1,5 и количество прочтений на килобазу транскрипта на миллион картированных прочтений (RPKM) > 10. Наконец, биологические процессы будут определены www.pantherdb.org на основе DEG. Также будет проведена замена внутренних контролей на экспериментальные данные с последующей группировкой пациентов с использованием ДЭГ. Оба подхода дают схожие результаты. Анализ мощности, основанный на предварительных результатах биопсии кожи, показал, что 19 парных образцов будут иметь мощность 83,6% со стандартным отклонением (SD) 0,8. Однако РНК из мышечной ткани обычно более высокого качества, чем образцы кожи. Следовательно, исследователи ожидают, что массовая секвенирование РНК будет иметь меньшее стандартное отклонение и потребует 14 парных образцов на группу; это включает образцы после обработки.

Комбинированная пластичность генов и эпигенетических сигнатур на клеточном уровне будет оцениваться Multiome с использованием платформы Genomic x10. Мультиомный анализ стандартизирован Genomic x10. Для визуального представления будет использоваться Seurat. Анализ мощности для Multiome показал, что необходимо 3-4 парных образца на группу. В настоящее время принятый анализ заключается в том, что парные образцы, принадлежащие к одной и той же группе участников, объединены, и множественный анализ, подобный t-тесту, для каждого кластера клеток проводится против другой группы.

Анализ IHC будет сосредоточен на пластичности сенсорных нейритов с использованием маркеров для подмножеств сенсорных нейронов и с использованием микроскопии Light Sheet для измерения длины нейритов и ветвления для целых биопсий. Исследователи также планируют использовать метод Glyclick, который позволяет получать стабильные и гомогенные конъюгаты антител для иммуноглобина G из нескольких видов и подклассов. Если возможно, также будет проведена протеомика. FC будет использоваться для профилирования иммунных и сосудистых клеток. Анализ мощности показал, что для IHC и FC потребуется 8 образцов на группу.

Анализ клинических данных:

P<0,05 будет использоваться как уровень значимости. Тест Шапиро-Уилка проверит нормальность данных. Для описания данных будет использоваться среднее значение (SD) или медиана (межквартильный размах, IQR), в зависимости от нормальности. Для нормально распределенных и непрерывных данных повторяющиеся измерения Анализ дисперсии (ANOVA) будет использоваться для анализа различий в эффекте лечения с использованием группы и времени в качестве факторов. Если будут обнаружены значительные различия, они будут дополнительно проанализированы с помощью апостериорного теста Даннета. Искаженные или порядковые данные будут проанализированы с помощью дисперсионного анализа Фридмана для каждой группы отдельно с использованием критерия Данна в качестве апостериорного критерия для временных различий. U-критерий Манна-Уитни будет использоваться для анализа различий между группами в разные моменты времени с использованием поправки Бонферрони для множественного тестирования.

Многомерная статистика будет использоваться для выявления корреляций между значительно измененными биомаркерами и другими переменными. Анализ основных компонентов (PCA) будет использоваться для выявления умеренных или сильных выбросов. Затем будет использоваться ортогональный частичный дискриминантный анализ методом наименьших квадратов (OPLS-DA) для регрессии принадлежности к группе с использованием биомаркеров в качестве регрессоров. Для корреляций между биомаркерами и клиническими переменными будет выполнено моделирование OPLS. Значение «Влияние переменной на прогноз» (VIP) указывает на релевантность каждой переменной X, объединенной во все измерения, а переменные Y указывают на группу переменных, которые лучше всего объясняют Y. VIP > 1,0 считается значимым. R2 описывает качество подгонки, т. е. долю суммы квадратов всех переменных, объясняемую главным компонентом, тогда как Q2 описывает качество предсказания, т. е. долю общего изменения переменных, которая может быть предсказана основным компонентом. компонент с использованием методов перекрестной проверки. R2 не должен быть значительно выше, чем Q2, если значительно выше (>0,3), надежность модели плохая. Для проверки модели будет использоваться полученное перекрестно проверенное значение p дисперсионного анализа (CV-ANOVA). Модель OPLS-DA считается очень важной, если CV-ANOVA имеет p-значение <0,05.