外周 TMD 疼痛机制及 A 型肉毒杆菌毒素的作用

患者招募：

这些患者将在转介到瑞典胡丁厄卡罗林斯卡学院大学牙科诊所的口腔面部疼痛和下颌功能专科诊所的患者中招募，或通过广告招募。

随机化：

患者将由随机生成器 (www.randomization.com) 随机分配接受治疗。 对于每个参与者，治疗将由不参与数据收集的任何其他部分的研究人员写在一张纸条上，并放在密封的信封中。 不参与患者检查的第二个人将打开信封，准备装有随机溶液的注射器，并在检查者和患者进入检查室之前将其放置在检查室中。 肉毒杆菌毒素和生理盐水具有相同的外观，因此参与者和研究者将无法接受治疗分配。

程序：

参与者在第一次访问之前完成 TMD 诊断标准 (DC/TMD) 中包含的瑞典 Axis II 问卷的扩展和略微修改版本。 Axis II 问卷包含社会人口统计学问题、有关用于诊断目的的 TMD 症状和头痛（存在、持续时间和频率）的问题（症状问卷），以及用于评估身体和情绪功能的经过验证的工具。 然后根据 DC/TMD 轴 I 进行临床检查，其中还包括压力痛阈值、时间总和疼痛和条件性疼痛调制的记录。 在确保参与者满足合格标准后，从疼痛和非疼痛部位获得活检以供以后分析。 此后至少一周给予治疗。

活检：

将从咬肌和胫骨前肌（未处理的无痛内部对照）获得微生物活检。 在皮肤表面麻醉下，通过覆盖肌肉最突出部分的皮肤进行微生物活检。 将使用穿透深度为 11 mm、直径为 18 gauche (G)（咬肌）或 16 G（胫骨）的一次性活检器械。 活检仪器将由同轴针引导，插入深度为 10 毫米。 将对每块肌肉进行三到四次微活检，以确保获得足够的肌肉组织。 将同轴针沿肌肉长轴插入直至穿透筋膜，然后通过同轴针插入活检器械，采集一块约0.12cm*1.1cm的肌肉。 使用无菌探针将肌肉切片从活检仪器中取出，并立即放入冷冻管中，冷冻管在液氮中快速冷冻。 取出肌肉切片后，将用等渗盐水冲洗活检器械。 这个过程将重复两到三遍。 每次活检仪器将旋转 45°，以便从肌肉的新部分进行显微活检。 活组织检查将储存 (-80º) 在卡罗林斯卡医学院的牙科生物库中，直到进行分析。

活检分析：

活组织检查将通过大量核糖核酸测序 (RNA-seq)、Multiome（用于转座酶可及染色质 (ATAC) 和 RNA-seq 的组合单细胞分析）、免疫组织化学 (IHC)、光片显微镜和流式细胞术 ( FC) 位于圣安东尼奥的德克萨斯大学健康科学中心 (UTHSCSA) 和位于瑞典胡丁厄的卡罗林斯卡学院的活细胞成像设施。 非疼痛部位（胫骨前肌）的数据将从每位患者的疼痛部位（咬肌）数据中减去。 然后，可以对这些数据进行聚类。

对于大量 RNA seq，将选择差异表达基因 (DEG)，然后在 R (edgeR) 软件中对 DEG 进行经验分析以进行配对分析，以选择显着差异 (p<0.05) 度。 这是一种既定且标准化良好的方法。 进一步分析的选择标准是倍数电荷 (FC) > 1.5 和每千碱基转录本每百万映射读数 (RPKM) > 10。 最后，生物过程将由 www.pantherdb.org 基于 DEGs 定义。 还将根据实验数据对内部控制进行转换，然后使用 DEG 对患者进行聚类。 这两种方法产生相似的结果。 基于皮肤活检初步结果的功效分析表明，19 个配对样本将获得 83.6% 的功效，标准差 (SD) 为 0.8。 然而，来自肌肉组织的 RNA 通常比皮肤样本的质量更高。 因此，研究人员预计 bulk RNA-seq 的 SD 较小并且每组需要 14 个配对样本；这包括处理后的样本。

Multiome 将使用 Genomic x10 平台评估细胞水平上的组合基因和表观遗传特征可塑性。 多组分析由 Genomic x10 标准化。 对于视觉呈现，将使用修拉。 Multiome 的功效分析表明每组需要 3-4 个配对样本。 目前接受的分析是，属于同一参与者组的配对样本组合在一起，并且每个细胞簇的多个 t 检验类分析针对另一组运行。

IHC 分析将重点关注感觉神经突可塑性，使用感觉神经元亚群的标记物，并使用光片显微镜测量整个活检的神经突长度和分支。 研究人员还计划使用 Glyclick 方法为来自多个物种和亚类的免疫球蛋白 G 生成稳定且均一的抗体偶联物。 如果可能，还将进行蛋白质组学研究。 FC 将用于分析免疫和脉管系统细胞。 功效分析表明，IHC 和 FC 需要每组 8 个样本。

临床数据分析：

P<0.05 将用作显着性水平。 Shapiro-Wilk 检验将检验数据的正态性。 均值 (SD) 或中位数（四分位数间距，IQR）取决于正态性，将用于描述数据。 对于正态分布和连续数据，重复测量方差分析 (ANOVA) 将用于分析以组和时间为因素的治疗效果差异。 如果发现显着差异，将使用 Dunnet 的事后检验进一步分析这些差异。 偏斜或有序的数据将使用弗里德曼方差分析对每组分别进行分析，并使用邓恩检验作为时间差异的事后检验。 Mann-Whitney U 检验将用于分析不同时间点的组间差异，使用 Bonferroni 校正进行多重检验。

多变量统计将用于识别显着变化的生物标志物和其他变量之间的相关性。 主成分分析 (PCA) 将用于识别中度或强异常值。 正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 然后将用于使用生物标志物作为回归变量来回归组成员身份。 对于生物标志物和临床变量之间的相关性，将执行 OPLS 建模。 变量对投影的影响 (VIP) 值表示每个 X 变量在所有维度上的相关性，Y 变量表示最能解释 Y 的变量组。VIP > 1.0 被认为是显着的。 R2 描述拟合优度，即由主成分解释的所有变量的平方和的分数，而 Q2 描述预测的优度，即可以由主成分预测的变量的总变异的分数使用交叉验证方法的组件。 R2 不应显着高于 Q2，如果显着高于 (>0.3) 则模型的稳健性较差。 为了验证模型，将使用获得的交叉验证方差分析 (CV-ANOVA) p 值。 如果 CV-ANOVA 的 p 值 < 0.05，则 OPLS-DA 模型被认为具有重要意义。