Perifeeriset TMD-kipumekanismit ja botuliinitoksiini A:n vaikutus

Potilaiden rekrytointi:

Potilaat rekrytoidaan niiden joukosta, jotka on lähetetty Karolinska Institutetin Huddingen yliopiston hammasklinikan suu- ja leukakipujen erikoisklinikalle tai ilmoituksen kautta.

Satunnaistaminen:

Satunnaisgeneraattori (www.randomization.com) määrää potilaat satunnaisesti hoitoon. Jokaiselle osallistujalle kirjoitetaan hoidon muistiinpanoon ja sinetöityyn kirjekuoreen tutkija, joka ei osallistu mihinkään muuhun tiedonkeruun osaan. Toinen henkilö, joka ei osallistu potilaan tutkimukseen, avaa kirjekuoren, valmistelee satunnaistetun liuoksen sisältävän ruiskun ja sijoittaa sen tutkimushuoneeseen ennen kuin tutkija ja potilas tulevat siihen. Botuliinitoksiini ja suolaliuos ovat ulkonäöltään identtisiä, joten osallistuja ja tutkija ovat naamioituneet hoitotehtävään.

Toimenpide:

Osallistujat täyttävät laajennetun ja hieman muokatun version ruotsalaisesta Axis II -kyselystä, joka sisältyy TMD:n diagnostisiin kriteereihin (DC/TMD) ennen ensimmäistä käyntiä. Axis II -kyselylomake sisältää sosiodemografisen kysymyksen, TMD-oireita ja päänsärkyä koskevia kysymyksiä (esiintyminen, kesto ja esiintymistiheys), joita käytetään diagnostisiin tarkoituksiin (Symptom Questionnaire), sekä validoituja instrumentteja fyysisen ja emotionaalisen toiminnan arvioimiseksi. Sitten suoritetaan kliininen tutkimus DC/TMD-akselin I mukaisesti, joka sisältää myös tallennukset painekipukynnyksestä, ajallinen summakipu ja ehdollinen kivun modulaatio. Kun on varmistettu, että osallistuja täyttää kelvolliset kriteerit, biopsiat otetaan kivuliasta ja kivuttomasta kohdasta myöhempää analyysiä varten. Tämän jälkeen hoitoa annetaan vähintään yksi viikko.

Biopsiat:

Mikrobiopsiat otetaan purema- ja anteriorisesta säärilihaksesta (käsittelemätön kivuton sisäinen kontrolli). Mikrobiopsiat otetaan ihon läpi, joka peittää lihaksen näkyvimmän osan ihon pintapuudutuksessa. Käytetään kertakäyttöistä biopsiainstrumenttia, jonka tunkeutumissyvyys on 11 mm ja halkaisija 18 gauche (G) (masseter) tai 16G (tibialis). Biopsiainstrumenttia ohjataan koaksiaalineulalla, joka työnnetään 10 mm syvyyteen. Jokaisesta lihaksesta otetaan 3–4 mikrobipsiaa sen varmistamiseksi, että lihaskudosta saadaan riittävästi. Koaksiaalinen neula työnnetään pitkin lihasten pitkää akselia, kunnes fascia on läpäissyt, ja sitten biopsiainstrumentti työnnetään koaksiaalisen neulan läpi ja lihaksen pala, jonka koko on noin 0,12 cm * 1,1 cm, kerätään. Lihasosa poistetaan biopsia-instrumentista steriilillä koettimella ja laitetaan välittömästi kryoputkeen, joka on pikajäädytetty nestemäisessä typessä. Lihasosan poistamisen jälkeen biopsia-instrumentti huuhdellaan isotonisella suolaliuoksella. Tämä toimenpide toistetaan kaksi tai kolme kertaa. Joka kerta biopsiainstrumenttia käännetään 45°, jotta mikrobiopsia otettaisiin uudesta lihaksen osasta. Biopsiat säilytetään (-80º) Karolinska Institutetin hammasbiopankissa analyysiin asti.

Biopsian analyysit:

Biopsiat analysoidaan bulkribonukleiinihapposekvensoinnilla (RNA-seq), Multiomella (yhdistetty yhden solun määritys transposaasi-pääsevän kromatiinin (ATAC) ja RNA-seq:n suhteen), immunohistokemialla (IHC), valolevymikroskopialla ja virtaussytometrialla ( FC) Texasin yliopiston terveystiedekeskuksessa San Antoniossa (UTHSCSA) ja Live Cell Imaging Facilityssä Karolinska Institutetissa, Huddingessa, Ruotsissa. Tiedot kivuttomasta kohdasta (sääriluun etuosa vähennetään jokaisen potilaan kivuliasta kohtaa (masseter) koskevista tiedoista). Sitten nämä tiedot voidaan ryhmitellä.

Bulkki-RNA-sekvenssille valitaan differentiaalisesti ekspressoituneet geenit (DEG) ja sitten suoritetaan parillinen analyysi DEG:ien empiirisessä analyysissä R (edgeR) -ohjelmistossa merkittävästi erilaisten valitsemiseksi (p < 0,05) DEG. Tämä on vakiintunut ja hyvin standardoitu lähestymistapa. Valintakriteerit lisäanalyysille ovat kertamaksu (FC) > 1,5 ja lukemat per kilometri transkription miljoonaa kartoitettua lukua (RPKM) > 10. Lopuksi www.pantherdb.org määrittelee biologiset prosessit DEG:iden perusteella. Myös sisäisten kontrollien ala-asema kokeellisista tiedoista tehdään, mitä seuraa potilaiden klusterointi DEG:illä. Molemmat lähestymistavat tuottavat samanlaisia ​​tuloksia. Tehoanalyysi, joka perustuu alustaviin ihobiopsian tuloksiin, osoitti, että 19 parinäytettä saa 83,6 % tehon keskihajonnan (SD) ollessa 0,8. Lihaskudoksesta peräisin oleva RNA on kuitenkin yleensä laadukkaampaa kuin ihonäytteet. Tästä syystä tutkijat odottavat, että bulkki-RNA-seq:llä on pienempi SD ja se vaatii 14 parillista näytettä ryhmää kohden; tämä sisältää näytteet käsittelyjen jälkeen.

Multiome arvioi yhdistetyn geenin ja epigeneettisen allekirjoituksen plastisuuden solutasolla käyttämällä Genomic x10 -alustaa. Multiomianalyysi on standardoitu Genomic x10:llä. Visuaaliseen esitykseen käytetään Seurat. Multiomen tehoanalyysi osoitti, että ryhmää kohden tarvitaan 3-4 parinäytettä. Tällä hetkellä hyväksytty analyysi on se, että samaan osallistujaryhmään kuuluvat parinäytteet yhdistettynä ja useat t-testin kaltaiset analyysit kullekin soluklusterille suoritetaan toista ryhmää vastaan.

IHC-analyysi keskittyy aistinvaraiseen neuriitin plastisuuteen käyttämällä markkereita aistihermosolujen alaryhmille ja käyttää Light Sheet -mikroskooppia mittaamaan neuriitin pituutta ja haarautumista kokonaisista biopsioista. Tutkijat aikovat myös käyttää Glyclick-menetelmää, joka tuottaa stabiileja ja homogeenisia vasta-ainekonjugaatteja immunoglobiini G:lle useista lajeista ja alaluokista. Mikäli mahdollista, tehdään myös proteomiikkaa. FC:tä käytetään immuuni- ja verisuonisolujen profilointiin. Tehoanalyysi osoitti, että IHC:tä ja FC:tä varten tarvitaan 8 näytettä ryhmää kohden.

Kliinisen tiedon analyysit:

P<0,05 käytetään merkitsevyystasona. Shapiro-Wilkin testi testaa tietojen normaaliutta. Keskiarvoa (SD) tai mediaania (interkvartiilialue, IQR) käytetään normaalista riippuen. Normaalisti jakautuneille ja jatkuville tiedoille toistettuja mittauksia käytetään varianssianalyysiä (ANOVA) analysoimaan hoidon vaikutuksen eroja tekijöinä ryhmä ja aika. Jos merkittäviä eroja havaitaan, niitä analysoidaan edelleen Dunnet'in posthoc-testillä. Väärät tai järjestystiedot analysoidaan Friedman ANOVA:lla kullekin ryhmälle erikseen käyttäen Dunnin testiä posthoc-testinä aikaerojen varalta. Mann-Whitneyn U-testiä käytetään ryhmien välisten erojen analysointiin eri ajankohtina käyttämällä Bonferroni-korjausta useisiin testauksiin.

Monimuuttujatilastojen avulla tunnistetaan merkittävästi muuttuneiden biomarkkerien ja muiden muuttujien välisiä korrelaatioita. Pääkomponenttianalyysiä (PCA) käytetään tunnistamaan kohtalaiset tai voimakkaat poikkeamat. Ortogonaalista osittaisten pienimmän neliösumman erotteluanalyysiä (OPLS-DA) käytetään sitten ryhmän jäsenyyden regressioon käyttämällä biomarkkereita regressoreina. Biomarkkerien ja kliinisten muuttujien välisten korrelaatioiden selvittämiseksi suoritetaan OPLS-mallinnus. Variable Influence on Projection (VIP) -arvo ilmaisee kunkin X-muuttujan relevanssin, joka on yhdistetty kaikissa ulottuvuuksissa, ja Y-muuttujat osoittavat muuttujaryhmän, joka parhaiten selittää Y:n. VIP-arvoa > 1,0 pidetään merkittävänä. R2 kuvaa sovituksen hyvyyttä, eli kaikkien muuttujien neliösumman murto-osaa, joka selitetään pääkomponentilla, kun taas Q2 kuvaa ennusteen hyvyyttä, eli muuttujien kokonaisvaihtelun murto-osaa, joka voidaan ennustaa pääkomponentilla komponentti ristiinvalidointimenetelmillä. R2 ei saisi olla huomattavasti suurempi kuin Q2, jos huomattavasti suurempi (>0,3), mallin robustisuus on huono. Mallin validoimiseksi käytetään saatua ristiinvalidoitua varianssianalyysin (CV-ANOVA) p-arvoa. OPLS-DA-mallia pidetään merkittävänä tärkeänä, jos CV-ANOVA:n p-arvo on < 0,05.