Mécanismes périphériques de la douleur TMD et effet de la toxine botulique A

Recrutement des patients :

Les patients seront recrutés parmi ceux référés à la Clinique spécialisée pour la douleur orofaciale et la fonction de la mâchoire à la Clinique dentaire universitaire, Karolinska Institutet, Huddinge, Suède, ou via une annonce.

Randomisation:

Les patients seront assignés au traitement au hasard par un générateur aléatoire (www.randomization.com). Pour chaque participant, le traitement sera écrit sur une note et placé dans une enveloppe scellée par un chercheur qui n'est impliqué dans aucune autre partie de la collecte de données. Une deuxième personne non impliquée dans l'examen du patient ouvrira l'enveloppe, préparera la seringue avec la solution randomisée et la placera dans la salle d'examen avant que l'examinateur et le patient n'y entrent. La toxine botulique et la solution saline ont une apparence identique, de sorte que le participant et l'investigateur seront masqués pour l'affectation au traitement.

Procédure:

Les participants remplissent une version étendue et légèrement modifiée du questionnaire suédois de l'Axe II inclus dans les critères de diagnostic du TMD (DC/TMD) avant la première visite. Le questionnaire de l'Axe II contient des questions sociodémographiques, des questions concernant les symptômes du TMD et les céphalées (présence, durée et fréquence) utilisées à des fins de diagnostic (questionnaire sur les symptômes) et des instruments validés pour évaluer la fonction physique et émotionnelle. Un examen clinique est ensuite effectué selon l'axe I DC/TMD qui comprend également des enregistrements du seuil de douleur à la pression, de la douleur de sommation temporelle et de la modulation de la douleur conditionnée. Après s'être assuré que le participant remplit les critères éligibles, des biopsies sont obtenues à partir d'un site douloureux et d'un site non douloureux pour une analyse ultérieure. Au moins une semaine après, le traitement est administré.

Biopsies :

Des microbiopsies seront obtenues à partir du muscle masséter et du muscle tibial antérieur (un contrôle interne indolore non traité). Les microbiopsies sont prises à travers la peau recouvrant la partie la plus proéminente du muscle sous anesthésie de la surface de la peau. Un instrument de biopsie jetable avec une profondeur de pénétration de 11 mm et un diamètre de 18 gauche (G) (masseter) ou 16G (tibialis) sera utilisé. L'instrument de biopsie sera guidé avec une aiguille coaxiale, qui sera insérée à une profondeur de 10 mm. Trois à quatre microbiopsies seront prélevées sur chaque muscle pour s'assurer que suffisamment de tissu musculaire est obtenu. L'aiguille coaxiale sera insérée le long de l'axe longitudinal des muscles jusqu'à ce que le fascia soit pénétré et l'instrument de biopsie est ensuite inséré à travers l'aiguille coaxiale et un morceau de muscle d'une taille d'environ 0,12 cm * 1,1 cm est collecté. La section musculaire sera retirée de l'instrument de biopsie à l'aide d'une sonde stérile et placée immédiatement dans un cryotube qui sera congelé rapidement dans de l'azote liquide. Après le retrait de la section musculaire, l'instrument de biopsie sera rincé avec une solution saline isotonique. Cette procédure sera répétée deux à trois fois. Chaque fois, l'instrument de biopsie sera tourné de 45° afin que la microbiopsie soit prélevée sur une nouvelle partie du muscle. Les biopsies seront stockées (-80º) dans la biobanque dentaire du Karolinska Institutet jusqu'à l'analyse.

Analyses de biopsies :

Les biopsies seront analysées par séquençage d'acide ribonucléique en vrac (ARN-seq), Multiome (essai unicellulaire combiné pour la chromatine accessible à la transposase (ATAC) et ARN-seq), immunohistochimie (IHC), microscopie à feuille de lumière et cytométrie en flux ( FC) au Centre des sciences de la santé de l'Université du Texas à San Antonio (UTHSCSA) et au Live Cell Imaging Facility du Karolinska Institutet, Huddinge, Suède. Les données du site non douloureux (jambier antérieur) seront soustraites des données du site douloureux (masseter) pour chaque patient. Ensuite, ces données peuvent être regroupées.

Pour le seq d'ARN en vrac, des gènes exprimés de manière différentielle (DEG) seront sélectionnés, puis une analyse appariée sera effectuée dans le cadre d'une analyse empirique des DEG dans le logiciel R (edgeR) pour sélectionner des gènes significativement différents (p <0,05) DEG. Il s'agit d'une approche établie et bien normalisée. Les critères de sélection pour une analyse plus approfondie sont la charge de pliage (FC)> 1,5 et les lectures par kilobase de transcription par million de lectures cartographiées (RPKM)> 10. Enfin, les processus biologiques seront définis par www.pantherdb.org sur la base des DEG. Une sous-station de contrôles internes à partir de données expérimentales sera également réalisée, suivie d'un regroupement de patients utilisant des DEG. Les deux approches produisent des résultats similaires. L'analyse de puissance basée sur les résultats préliminaires des biopsies cutanées a montré que 19 échantillons appariés obtiendront une puissance de 83,6 % avec un écart type (SD) de 0,8. Cependant, l'ARN du tissu musculaire est généralement de meilleure qualité que les échantillons de peau. Par conséquent, les enquêteurs prévoient que l'ARN-seq en vrac aura moins de SD et nécessitera 14 échantillons appariés par groupe ; cela inclut les échantillons après les traitements.

La plasticité combinée des gènes et des signatures épigénétiques au niveau cellulaire sera évaluée par Multiome à l'aide de la plateforme Genomic x10. L'analyse multiome est standardisée par Genomic x10. Pour la présentation visuelle, Seurat sera utilisé. L'analyse de puissance pour Multiome a montré que 3 à 4 échantillons appariés par groupe sont nécessaires. L'analyse actuellement acceptée est que des échantillons appariés appartenant au même groupe de participants combinés et plusieurs analyses de type test t pour chaque groupe de cellules sont exécutés contre un autre groupe.

L'analyse IHC se concentrera sur la plasticité sensorielle des neurites à l'aide de marqueurs pour des sous-ensembles de neurones sensoriels et utilisera la microscopie Light Sheet pour mesurer la longueur et la ramification des neurites pour des biopsies entières. Les chercheurs prévoient également d'utiliser la méthode Glyclick qui génère des conjugués d'anticorps stables et homogènes pour l'immunoglobine G de plusieurs espèces et sous-classes. Si possible, la protéomique sera également effectuée. FC sera utilisé pour profiler les cellules immunitaires et vasculaires. L'analyse de puissance a montré que 8 échantillons par groupe seront nécessaires pour l'IHC et le FC.

Analyses des données cliniques :

P<0,05 sera utilisé comme niveau de signification. Le test de Shapiro-Wilk testera la normalité des données. Moyenne (SD) ou médiane (écart interquartile, IQR), selon la normalité, sera utilisée pour décrire les données. Pour les données normalement distribuées et continues, des mesures répétées L'analyse de la variance (ANOVA) sera utilisée pour analyser les différences d'effet de traitement avec le groupe et le temps comme facteurs. Si des différences significatives sont trouvées, elles seront analysées plus en détail avec le test posthoc de Dunnet. Les données asymétriques ou ordinales seront analysées avec Friedman ANOVA pour chaque groupe séparément avec le test de Dunn comme test posthoc pour les différences de temps. Le test U de Mann-Whitney sera utilisé pour analyser les différences entre les groupes à différents moments, en utilisant la correction de Bonferroni pour les tests multiples.

Des statistiques multivariées seront utilisées pour identifier les corrélations entre des biomarqueurs significativement modifiés et d'autres variables. L'analyse en composantes principales (ACP) sera utilisée pour identifier les valeurs aberrantes modérées ou fortes. L'analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) sera ensuite utilisée pour régresser l'appartenance à un groupe en utilisant les biomarqueurs comme régresseurs. Pour les corrélations entre les biomarqueurs et les variables cliniques, une modélisation OPLS sera effectuée. La valeur de l'influence variable sur la projection (VIP) indique la pertinence de chaque variable X regroupée sur toutes les dimensions et les variables Y indiquent le groupe de variables qui expliquent le mieux Y. VIP > 1,0 est considéré comme significatif. R2 décrit la qualité de l'ajustement, c'est-à-dire la fraction de la somme des carrés de toutes les variables expliquées par une composante principale, tandis que Q2 décrit la qualité de la prédiction, c'est-à-dire la fraction de la variation totale des variables qui peut être prédite par une composante principale. composant à l'aide de méthodes de validation croisée. R2 ne doit pas être considérablement plus élevé que Q2, si considérablement plus élevé (>0,3) la robustesse du modèle est faible. Pour valider le modèle, une valeur de p de l'analyse de la variance (CV-ANOVA) validée croisée sera utilisée. Le modèle OPLS-DA est considéré comme d'une importance significative si le CV-ANOVA a une valeur p < 0,05.