Mechanismy periferní bolesti TMD a účinek botulotoxinu A

Nábor pacientů:

Pacienti budou zařazováni mezi pacienty doporučené na specializovanou kliniku pro orofaciální bolest a funkci čelisti na Univerzitní zubní klinice, Karolinska Institutet, Huddinge, Švédsko, nebo prostřednictvím reklamy.

Randomizace:

Pacienti budou náhodně přiřazeni k léčbě náhodným generátorem (www.randomization.com). Pro každého účastníka bude léčba napsána na poznámku a vložena do zalepené obálky výzkumným pracovníkem, který se nepodílí na žádné jiné části sběru dat. Druhá osoba, která se nezúčastní vyšetření pacienta, otevře obálku, připraví injekční stříkačku s náhodně vybraným roztokem a umístí ji do vyšetřovny, než do ní vstoupí vyšetřující a pacient. Botulotoxin a fyziologický roztok mají identický vzhled, takže účastník a zkoušející budou maskováni pro přidělení léčby.

Postup:

Účastníci před první návštěvou vyplní rozšířenou a mírně upravenou verzi švédského dotazníku osy II, který je součástí diagnostických kritérií pro TMD (DC/TMD). Dotazník Axis II obsahuje sociodemografickou otázku, otázky týkající se příznaků TMD a bolesti hlavy (přítomnost, trvání a frekvence) používané pro diagnostické účely (Dotazník příznaků) a ověřené nástroje pro hodnocení fyzických a emocionálních funkcí. Poté se provede klinické vyšetření podle osy I DC/TMD, která také zahrnuje záznamy prahu tlakové bolesti, dočasné sumační bolesti a podmíněné modulace bolesti. Poté, co se ujistil, že účastník splňuje způsobilá kritéria, jsou odebrány biopsie z bolestivého a nebolestivého místa pro pozdější analýzu. Nejméně jeden týden po léčbě se podává.

Biopsie:

Mikrobiopsie budou získány z žvýkacího svalu a předního tibiálního svalu (neléčená bezbolestná vnitřní kontrola). Mikrobiopsie se odebírají přes kůži překrývající nejprominentnější část svalu pod povrchovou anestezií kůže. Bude použit jednorázový bioptický nástroj s hloubkou průniku 11 mm a průměrem 18 gauche (G) (žvýkací sval) nebo 16G (tibialis). Bioptický nástroj bude veden koaxiální jehlou, která bude zavedena do hloubky 10 mm. Z každého svalu budou odebrány tři až čtyři mikrobiopsie, aby se zajistilo získání dostatečné svalové tkáně. Koaxiální jehla se zavede podél dlouhé osy svalů, dokud nepronikne fascie, a poté se koaxiální jehlou zavede bioptický nástroj a odebere se kousek svalu o velikosti přibližně 0,12 cm x 1,1 cm. Svalový řez bude vyjmut z bioptického nástroje pomocí sterilní sondy a okamžitě vložen do kryozkumavky, která se rychle zmrazí v tekutém dusíku. Po odstranění svalové části bude bioptický nástroj opláchnut izotonickým fyziologickým roztokem. Tento postup se bude opakovat dvakrát až třikrát. Pokaždé, když se bioptický nástroj otočí o 45°, aby byla mikrobiopsie odebrána z nové části svalu. Biopsie budou až do analýzy uloženy (-80º) v zubní biobance Karolinska Institutet.

Analýzy biopsií:

Biopsie budou analyzovány hromadným sekvenováním ribonukleové kyseliny (RNA-seq), Multiome (kombinovaný jednobuněčný test na chromatin přístupný transposáze (ATAC) a RNA-seq), imunohistochemií (IHC), mikroskopií na světelném listu a průtokovou cytometrií ( FC) na University of Texas Health Science Center v San Antoniu (UTHSCSA) a na Live Cell Imaging Facility v Karolinska Institutet, Huddinge, Švédsko. Údaje o nebolestivém místě (přední tibialis budou odečteny od údajů o bolestivém místě (žvýkačce) u každého pacienta). Poté lze tato data seskupovat.

Pro hromadné sekvence RNA budou vybrány odlišně exprimované geny (DEGs) a poté bude provedena párová analýza v rámci empirické analýzy DEGs v R (edgeR) softwaru pro výběr významně odlišných (p<0,05) DEGs. Toto je zavedený a dobře standardizovaný přístup. Kritéria výběru pro další analýzu jsou násobný náboj (FC)>1,5 a čtení na kilobázi transkriptu na milion mapovaných čtení (RPKM)>10. Konečně biologické procesy budou definovány na www.pantherdb.org na základě DEGs. Bude také provedeno substanice interních kontrol z experimentálních dat, následovaná shlukováním pacientů pomocí DEGs. Oba přístupy poskytují podobné výsledky. Výkonová analýza založená na předběžných výsledcích kožních biopsií ukázala, že 19 párových vzorků získá 83,6% výkon se standardní odchylkou (SD) 0,8. RNA ze svalové tkáně je však obvykle kvalitnější než vzorky kůže. Vyšetřovatelé tedy předpokládají, že hromadná RNA-seq bude mít menší SD a bude vyžadovat 14 spárovaných vzorků na skupinu; to zahrnuje vzorky po ošetření.

Kombinovaná plasticita genu a epigenetického podpisu na buněčných úrovních bude hodnocena pomocí Multiome na platformě Genomic x10. Multiomová analýza je standardizována pomocí Genomic x10. Pro vizuální prezentaci bude použit Seurat. Analýza výkonu pro Multiome ukázala, že jsou potřeba 3-4 spárované vzorky na skupinu. V současnosti přijímaná analýza spočívá v tom, že spárované vzorky patřící do stejné skupiny účastníků se spojí a vícenásobná analýza podobná t-testu pro každý buněčný shluk probíhá proti jiné skupině.

Analýza IHC se zaměří na plasticitu senzorických neuritů pomocí markerů pro podskupiny senzorických neuronů a použije mikroskopii Light Sheet k měření délky a větvení neuritů pro celé biopsie. Výzkumníci také plánují použít metodu Glyclick, která generuje stabilní a homogenní konjugáty protilátek pro imunoglobin G z několika druhů a podtříd. Bude-li to možné, bude provedena i proteomika. FC bude použit k profilování imunitních a vaskulaturních buněk. Analýza výkonu ukázala, že pro IHC a FC bude potřeba 8 vzorků na skupinu.

Analýzy klinických dat:

P<0,05 bude použito jako hladina významnosti. Shapiro-Wilkův test bude testovat normalitu dat. Pro popis dat bude použit průměr (SD) nebo medián (interkvartilní rozmezí, IQR), v závislosti na normalitě. Pro normálně distribuovaná a kontinuální data se použije opakovaná měření Analýza rozptylu (ANOVA) k analýze rozdílů v účinku léčby se skupinou a časem jako faktory. Pokud se najdou významné rozdíly, budou dále analyzovány Dunnetovým posthoc testem. Data, která jsou zkreslená nebo ordinální, budou analyzována pomocí Friedman ANOVA pro každou skupinu zvlášť s Dunnovým testem jako posthoc testem na časové rozdíly. Mann-Whitney U-test bude použit k analýze rozdílů mezi skupinami v různých časových bodech s použitím Bonferroniho korekce pro vícenásobné testování.

K identifikaci korelací mezi významně změněnými biomarkery a dalšími proměnnými bude použita vícerozměrná statistika. K identifikaci středních nebo silných odlehlých hodnot bude použita analýza hlavních komponent (PCA). Ortogonální parciální diskriminační analýza nejmenších čtverců (OPLS-DA) pak bude použita k regresi členství ve skupině pomocí biomarkerů jako regresorů. Pro korelace mezi biomarkery a klinickými proměnnými bude provedeno OPLS modelování. Hodnota proměnného vlivu na projekci (VIP) ukazuje relevanci každé X-proměnné sdružené ve všech dimenzích a Y-proměnné označují skupinu proměnných, které nejlépe vysvětlují Y. VIP > 1,0 je považováno za významné. R2 popisuje dobrou shodu, tj. zlomek součtu čtverců všech proměnných vysvětlených hlavní složkou, zatímco Q2 popisuje kvalitu predikce, tj. zlomek celkové variace proměnných, kterou lze predikovat hlavní složkou. komponentu pomocí metod křížové validace. R2 by nemělo být výrazně vyšší než Q2, pokud je podstatně vyšší (>0,3), je robustnost modelu špatná. K validaci modelu bude použita získaná křížově validovaná analýza variance (CV-ANOVA) p-hodnoty. Model OPLS-DA je považován za významný, pokud má CV-ANOVA p-hodnotu < 0,05.