Perifere TMD-smertemekanismer og effekten av botulinumtoksin A

Pasientrekruttering:

Pasientene vil bli rekruttert blant de som henvises til Spesialistklinikken for orofacial smerte og kjevefunksjon ved Universitetstannklinikken, Karolinska Institutet, Huddinge, Sverige, eller via annonse.

Randomisering:

Pasienter vil bli tilfeldig tildelt behandling av en tilfeldig generator (www.randomization.com). For hver deltaker vil behandlingen bli skrevet på en lapp og lagt i en forseglet konvolutt av en forsker som ikke er involvert i noen annen del av datainnsamlingen. En annen person som ikke er involvert i pasientundersøkelsen vil åpne konvolutten, klargjøre sprøyten med den randomiserte løsningen og plassere den i undersøkelsesrommet før undersøker og pasient går inn i den. Botulinumtoksin og saltvann har identisk utseende, så deltakeren og etterforskeren vil bli maskert til behandlingsoppdraget.

Fremgangsmåte:

Deltakerne fyller ut en utvidet og litt modifisert versjon av det svenske Axis II-spørreskjemaet inkludert i Diagnostic Criteria for TMD (DC/TMD) før det første besøket. Axis II-spørreskjemaet inneholder sosiodemografiske spørsmål, spørsmål angående TMD-symptomer og hodepine (tilstedeværelse, varighet og frekvens) brukt til diagnostiske formål (Symptom Questionnaire), og validerte instrumenter for å vurdere fysisk og emosjonell funksjon. Det utføres deretter en klinisk undersøkelse i henhold til DC/TMD Axis I som også inkluderer registreringer av trykksmerteterskel, temporal summasjonssmerte og betinget smertemodulasjon. Etter å ha sikret at deltakeren oppfyller de kvalifiserte kriteriene, innhentes biopsier fra et smertefullt og et ikke-smertefullt sted for senere analyse. Minst en uke etter behandling gis.

Biopsier:

Mikrobiopsier vil bli innhentet fra masseter og anterior tibialis muskel (en ubehandlet smertefri intern kontroll). Mikrobiopsiene tas gjennom huden som overlegger den mest fremtredende delen av muskelen under hudoverflateanestesi. Det vil bli brukt et engangsbiopsiinstrument med en penetrasjonsdybde på 11 mm og en diameter på 18 gauche (G) (masseter) eller 16G (tibialis). Biopsiinstrumentet vil bli ført med en koaksial nål, som settes inn til en dybde på 10 mm. Tre til fire mikrobiopsier vil bli tatt fra hver muskel for å sikre at tilstrekkelig muskelvev oppnås. Koaksialnålen vil bli satt inn langs musklenes langakse inntil fascia er penetrert og biopsiinstrumentet settes deretter inn gjennom koaksialnålen og et stykke av muskelen med en størrelse på ca. 0,12 cm * 1,1 cm samles. Muskelseksjonen vil bli fjernet fra biopsiinstrumentet ved hjelp av en steril sonde og umiddelbart lagt i et kryotube som er hurtigfrosset i flytende nitrogen. Etter fjerning av muskelseksjonen vil biopsiinstrumentet skylles med isotonisk saltvann. Denne prosedyren gjentas to til tre ganger. Hver gang vil biopsiinstrumentet roteres 45° slik at mikrobiopsien blir tatt fra en ny del av muskelen. Biopsiene vil bli lagret (-80º) i Karolinska Institutets tannbiobank frem til analyse.

Analyser av biopsier:

Biopsiene vil bli analysert med bulk ribonukleinsyresekvensering (RNA-seq), Multiome (kombinert enkeltcelleanalyse for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) og RNA-seq), immunhistokjemi (IHC), lysarkmikroskopi og flowcytometri ( FC) ved University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA) og ved Live Cell Imaging Facility ved Karolinska Institutet, Huddinge, Sverige. Data for det ikke-smertefulle stedet (anterior tibialis vil bli trukket fra data for det smertefulle stedet (masseter) for hver pasient. Deretter kan disse dataene grupperes.

For bulk RNA-sekvens vil differensielt uttrykte gener (DEGs) bli valgt, og deretter vil paret analyse bli kjørt innen empirisk analyse av DEGs i R (edgeR) programvare for å velge signifikant forskjellige (p<0,05) DEGs. Dette er en etablert og godt standardisert tilnærming. Utvalgskriterier for videre analyse er fold charge (FC)>1,5 og Reads Per Kilobase of transcript per Million mapd reads (RPKM)>10. Til slutt vil biologiske prosesser bli definert av www.pantherdb.org på basis av DEG. Understasjonering av interne kontroller fra eksperimentelle data vil også bli gjort, etterfulgt av gruppering av pasienter ved bruk av DEG. Begge tilnærmingene gir lignende resultater. Effektanalyse basert på foreløpige resultater fra hudbiopsier viste at 19 sammenkoblede prøver vil oppnå 83,6 % kraft med et standardavvik (SD) på 0,8. Imidlertid er RNA fra muskelvev vanligvis av høyere kvalitet enn hudprøver. Derfor forventer etterforskerne at bulk RNA-seq vil ha lavere SD og krever 14 parede prøver per gruppe; dette inkluderer prøver etter behandlinger.

Kombinert gen og epigenetisk signaturplastisitet på cellulære nivåer vil bli evaluert av Multiome ved å bruke Genomic x10-plattformen. Multiome-analyse er standardisert av Genomic x10. For visuell presentasjon vil Seurat bli brukt. Kraftanalyse for Multiome viste at det trengs 3-4 parvise prøver per gruppe. For tiden akseptert analyse er at sammenkoblede prøver som tilhører den samme deltakergruppen, kombinert og flere t-testlignende analyser for hver celleklynge kjøres mot en annen gruppe.

IHC-analysen vil fokusere på sensorisk neurittplastisitet ved å bruke markører for undergrupper av sensoriske nevroner og bruke Light Sheet-mikroskopi for å måle neurittlengde og forgrening for hele biopsier. Etterforskerne planlegger også å bruke Glyclick-metoden som genererer stabile og homogene antistoffkonjugater for immunglobin G fra flere arter og underklasser. Om mulig vil også proteomikk bli gjort. FC vil bli brukt til å profilere immun- og vaskulaturceller. Kraftanalyse viste at 8 prøver per gruppe vil være nødvendig for IHC og FC.

Analyser av kliniske data:

P<0,05 vil bli brukt som signifikansnivå. Shapiro-Wilks test vil teste for normaliteten til data. Gjennomsnitt (SD) eller median (interkvartilområde, IQR), avhengig av normalitet, vil bli brukt for å beskrive dataene. For normalfordelte og kontinuerlige data vil gjentatte tiltak Variansanalyse (ANOVA) brukes for å analysere forskjeller i behandlingseffekt med Gruppe og Tid som faktorer. Hvis det blir funnet signifikante forskjeller, vil disse bli videre analysert med Dunnets posthoc-test. Data som er skjeve eller ordinale vil bli analysert med Friedman ANOVA for hver gruppe separat med Dunns test som posthoc test for tidsforskjeller. Mann-Whitney U-testen vil bli brukt til å analysere forskjeller mellom grupper på forskjellige tidspunkter, ved å bruke Bonferroni-korreksjon for flere tester.

Multivariat statistikk vil bli brukt for å identifisere korrelasjoner mellom signifikant endrede biomarkører og andre variabler. Hovedkomponentanalyse (PCA) vil bli brukt for å identifisere moderate eller sterke uteliggere. Ortogonal partiell minste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA) vil deretter bli brukt til å regressere gruppemedlemskap ved å bruke biomarkørene som regressorer. For korrelasjoner mellom biomarkører og kliniske variabler vil OPLS-modellering bli utført. Variable Influence on Projection (VIP)-verdien indikerer relevansen av hver X-variabel samlet over alle dimensjoner og Y-variablene indikerer gruppen av variabler som best forklarer Y. VIP > 1.0 anses som signifikant. R2 beskriver godheten av tilpasning, dvs. brøkdelen av summen av kvadrater av alle variablene forklart av en hovedkomponent, mens Q2 beskriver godheten til prediksjon, dvs. brøkdelen av den totale variasjonen av variablene som kan forutsies av en hovedkomponent. komponent ved bruk av kryssvalideringsmetoder. R2 bør ikke være betydelig høyere enn Q2, hvis vesentlig høyere (>0,3) er robustheten til modellen dårlig. For å validere modellen vil en innhentet kryssvalidert variansanalyse (CV-ANOVA) p-verdi benyttes. OPLS-DA-modellen anses som av vesentlig betydning dersom CV-ANOVA har en p-verdi < 0,05.