Mecanismos de dor na DTM periférica e o efeito da toxina botulínica A

Recrutamento de pacientes:

Os pacientes serão recrutados entre os encaminhados para a Clínica Especializada em Dor Orofacial e Função da Mandíbula na Clínica Odontológica da Universidade, Karolinska Institutet, Huddinge, Suécia, ou por meio de anúncio.

Randomization:

Os pacientes serão designados aleatoriamente para tratamento por um gerador aleatório (www.randomization.com). Para cada participante o tratamento será escrito em nota e colocado em envelope lacrado por um pesquisador não envolvido em nenhuma outra parte da coleta de dados. Uma segunda pessoa não envolvida no exame do paciente abrirá o envelope, preparará a seringa com a solução randomizada e a colocará na sala de exame antes que o examinador e o paciente entrem. A toxina botulínica e a solução salina têm aparência idêntica, portanto, o participante e o investigador serão mascarados para designação de tratamento.

Procedimento:

Os participantes completam uma versão estendida e ligeiramente modificada do questionário sueco Axis II incluído nos critérios de diagnóstico para DTM (DC/TMD) antes da primeira visita. O questionário do Eixo II contém questões sociodemográficas, questões referentes a sintomas de DTM e cefaléia (presença, duração e frequência) utilizadas para fins diagnósticos (Symptom Questionnaire) e instrumentos validados para avaliação da função física e emocional. Um exame clínico é então realizado de acordo com o DC/TMD Axis I, que também inclui registros de limiar de dor à pressão, dor de soma temporal e modulação de dor condicionada. Depois de ter assegurado que o participante preenche os critérios elegíveis, as biópsias são obtidas de um local doloroso e não doloroso para análise posterior. Pelo menos uma semana após o tratamento é administrado.

Biópsias:

Microbiópsias serão obtidas do músculo masseter e tibial anterior (um controle interno indolor não tratado). As microbiópsias são feitas através da pele que recobre a parte mais proeminente do músculo sob anestesia da superfície da pele. Será utilizado um instrumento de biópsia descartável com profundidade de penetração de 11 mm e diâmetro de 18 gauche (G) (masseter) ou 16G (tibial). O instrumento de biópsia será guiado por uma agulha coaxial, que será inserida a uma profundidade de 10 mm. Três a quatro microbiópsias serão feitas de cada músculo para garantir que tecido muscular suficiente seja obtido. A agulha coaxial será inserida ao longo do longo eixo dos músculos até que a fáscia seja penetrada e então o instrumento de biópsia é inserido pela agulha coaxial e um pedaço do músculo com tamanho aproximado de 0,12 cm * 1,1 cm é coletado. A seção muscular será removida do instrumento de biópsia usando uma sonda estéril e imediatamente colocada em um criotubo que é congelado em nitrogênio líquido. Após a remoção da seção muscular, o instrumento de biópsia será lavado com solução salina isotônica. Este procedimento será repetido duas a três vezes. A cada vez, o instrumento de biópsia será girado 45° para que a microbiópsia seja retirada de uma nova porção do músculo. As biópsias serão armazenadas (-80º) no biobanco odontológico do Karolinska Institutet até a análise.

Análises de biópsias:

As biópsias serão analisadas com sequenciamento de ácido ribonucléico em massa (RNA-seq), Multiome (ensaio combinado de célula única para cromatina acessível por transposase (ATAC) e RNA-seq), imunohistoquímica (IHC), microscopia de folha de luz e citometria de fluxo ( FC) no University of Texas Health Science Center em San Antonio (UTHSCSA) e no Live Cell Imaging Facility no Karolinska Institutet, Huddinge, Suécia. Os dados do local não doloroso (tibial anterior serão subtraídos dos dados do local doloroso (masseter) para cada paciente. Em seguida, esses dados podem ser agrupados.

Para seq de RNA em massa, genes expressos diferencialmente (DEGs) serão selecionados e, em seguida, a análise pareada será executada dentro da análise empírica de DEGs no software R (edgeR) para selecionar significativamente diferentes (p<0,05) DEGs. Esta é uma abordagem estabelecida e bem padronizada. Os critérios de seleção para análise adicional são carga de dobra (FC)>1,5 e leituras por quilobase de transcrição por milhão de leituras mapeadas (RPKM)>10. Finalmente, os processos biológicos serão definidos por www.pantherdb.org com base em DEGs. Subestação de controles internos a partir de dados experimentais também será feita, seguida de agrupamento de pacientes usando DEGs. Ambas as abordagens produzem resultados semelhantes. A análise de potência baseada em resultados preliminares de biópsias de pele mostrou que 19 amostras pareadas obterão 83,6% de potência com um desvio padrão (DP) de 0,8. No entanto, o RNA do tecido muscular geralmente é de qualidade superior às amostras de pele. Assim, os investigadores antecipam que o bulk RNA-seq terá menor SD e requer 14 amostras pareadas por grupo; isso inclui amostras após os tratamentos.

A plasticidade combinada de genes e assinaturas epigenéticas em níveis celulares será avaliada pelo Multiome usando a plataforma Genomic x10. A análise multioma é padronizada pela Genomic x10. Para apresentação visual, Seurat será usado. A análise de potência para Multiome mostrou que são necessárias 3-4 amostras pareadas por grupo. A análise atualmente aceita é aquela em que amostras pareadas pertencentes ao mesmo grupo de participantes são combinadas e múltiplas análises do tipo teste t para cada agrupamento de células são executadas contra outro grupo.

A análise de IHC se concentrará na plasticidade de neuritos sensoriais usando marcadores para subconjuntos de neurônios sensoriais e usará microscopia de folha de luz para medir o comprimento e ramificação de neuritos para biópsias inteiras. Os pesquisadores também planejam usar o método Glyclick, que gera conjugados de anticorpos estáveis ​​e homogêneos para imunoglobulina G de várias espécies e subclasses. Se possível, também será feita proteômica. FC será usado para perfilar células imunes e vasculares. A análise de poder mostrou que 8 amostras por grupo serão necessárias para IHC e FC.

Análise de dados clínicos:

P<0,05 será utilizado como nível de significância. O teste de Shapiro-Wilk testará a normalidade dos dados. A média (DP) ou mediana (faixa interquartil, IQR), dependendo da normalidade, será usada para descrever os dados. Para medidas repetidas de dados normalmente distribuídos e contínuos, a Análise de Variância (ANOVA) será usada para analisar as diferenças no efeito do tratamento com Grupo e Tempo como fatores. Se forem encontradas diferenças significativas, elas serão analisadas posteriormente com o teste posthoc de Dunnet. Os dados assimétricos ou ordinais serão analisados ​​com ANOVA de Friedman para cada grupo separadamente com o teste de Dunn como teste posthoc para diferenças de tempo. O teste U de Mann-Whitney será usado para analisar as diferenças entre os grupos em diferentes momentos, usando a correção de Bonferroni para testes múltiplos.

Estatísticas multivariadas serão usadas para identificar correlações entre biomarcadores significativamente alterados e outras variáveis. A análise de componentes principais (PCA) será usada para identificar valores discrepantes moderados ou fortes. A análise discriminante de mínimos quadrados parciais ortogonais (OPLS-DA) será então usada para regredir a associação ao grupo usando os biomarcadores como regressores. Para correlações entre biomarcadores e variáveis ​​clínicas a modelagem OPLS será realizada. O valor Variable Influence on Projection (VIP) indica a relevância de cada variável X agrupada sobre todas as dimensões e as variáveis ​​Y indicam o grupo de variáveis ​​que melhor explicam Y. VIP > 1,0 é considerado significativo. R2 descreve a qualidade do ajuste, ou seja, a fração da soma dos quadrados de todas as variáveis ​​explicadas por um componente principal, enquanto Q2 descreve a qualidade da previsão, ou seja, a fração da variação total das variáveis ​​que podem ser previstas por um principal componente usando métodos de validação cruzada. R2 não deve ser consideravelmente maior que Q2, se substancialmente maior (>0,3) a robustez do modelo é ruim. Para validar o modelo, será usado um valor-p de análise de variância validada cruzada (CV-ANOVA). O modelo OPLS-DA é considerado de importância significativa se o CV-ANOVA tiver um valor de p < 0,05.