Periphere CMD-Schmerzmechanismen und die Wirkung von Botulinumtoxin A

Patientenrekrutierung:

Die Patienten werden unter denjenigen rekrutiert, die an die Fachklinik für orofaziale Schmerzen und Kieferfunktion an der Universitätszahnklinik, Karolinska Institutet, Huddinge, Schweden, oder über eine Anzeige überwiesen werden.

Randomisierung:

Die Patienten werden von einem Zufallsgenerator (www.randomization.com) zufällig einer Behandlung zugewiesen. Für jeden Teilnehmer wird die Behandlung auf einen Zettel geschrieben und von einem Forscher, der an keinem anderen Teil der Datenerhebung beteiligt ist, in einen versiegelten Umschlag gesteckt. Eine zweite Person, die nicht an der Untersuchung des Patienten beteiligt ist, öffnet den Umschlag, bereitet die Spritze mit der randomisierten Lösung vor und legt sie in den Untersuchungsraum, bevor der Untersucher und der Patient ihn betreten. Botulinumtoxin und Kochsalzlösung sehen identisch aus, sodass der Teilnehmer und der Prüfer für die Behandlungszuweisung maskiert werden.

Verfahren:

Die Teilnehmer füllen vor dem ersten Besuch eine erweiterte und leicht modifizierte Version des schwedischen Achse-II-Fragebogens aus, der in den Diagnosekriterien für CMD (DC/TMD) enthalten ist. Der Achse-II-Fragebogen enthält soziodemografische Fragen, Fragen zu CMD-Symptomen und Kopfschmerzen (Vorhandensein, Dauer und Häufigkeit), die für diagnostische Zwecke verwendet werden (Symptom-Fragebogen), und validierte Instrumente zur Beurteilung der körperlichen und emotionalen Funktion. Anschließend erfolgt eine klinische Untersuchung gemäß der DC/TMD-Achse I, die auch Aufzeichnungen der Druckschmerzschwelle, des zeitlichen Summenschmerzes und der konditionierten Schmerzmodulation umfasst. Nachdem sichergestellt wurde, dass der Teilnehmer die geeigneten Kriterien erfüllt, werden Biopsien von einer schmerzhaften und einer nicht schmerzhaften Stelle zur späteren Analyse entnommen. Mindestens eine Woche danach kann eine Behandlung erfolgen.

Biopsien:

Mikrobiopsien werden aus dem Masseter und dem Musculus tibialis anterior entnommen (eine unbehandelte schmerzfreie interne Kontrolle). Die Mikrobiopsien werden unter Hautoberflächenanästhesie durch die Haut entnommen, die den prominentesten Teil des Muskels bedeckt. Es wird ein Einweg-Biopsieinstrument mit einer Eindringtiefe von 11 mm und einem Durchmesser von 18 Gauche (G) (Masseter) oder 16 G (Tibialis) verwendet. Das Biopsieinstrument wird mit einer Koaxialnadel geführt, die bis zu einer Tiefe von 10 mm eingeführt wird. Von jedem Muskel werden drei bis vier Mikrobiopsien entnommen, um sicherzustellen, dass ausreichend Muskelgewebe gewonnen wird. Die Koaxialnadel wird entlang der Muskellängsachse bis zur Durchdringung der Faszie eingeführt und anschließend das Biopsieinstrument durch die Koaxialnadel eingeführt und ein Muskelstück mit einer Größe von ca. 0,12 cm * 1,1 cm entnommen. Der Muskelabschnitt wird mit einer sterilen Sonde aus dem Biopsieinstrument entnommen und sofort in ein Kryoröhrchen gegeben, das in flüssigem Stickstoff schockgefroren wird. Nach Entfernung des Muskelabschnitts wird das Biopsieinstrument mit isotonischer Kochsalzlösung gespült. Dieser Vorgang wird zwei- bis dreimal wiederholt. Jedes Mal wird das Biopsieinstrument um 45° gedreht, sodass die Mikrobiopsie von einem neuen Teil des Muskels entnommen wird. Die Biopsien werden bis zur Analyse in der zahnmedizinischen Biobank des Karolinska Institutet (-80º) gelagert.

Analysen von Biopsien:

Die Biopsien werden mit Bulk-Ribonukleinsäuresequenzierung (RNA-seq), Multiome (combined single-cell Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) and RNA-seq), Immunhistochemie (IHC), Lichtblattmikroskopie und Durchflusszytometrie analysiert ( FC) am University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA) und an der Live Cell Imaging Facility am Karolinska Institutet, Huddinge, Schweden. Die Daten der nicht schmerzhaften Stelle (anterior tibialis) werden von den Daten der schmerzhaften Stelle (Masseter) für jeden Patienten abgezogen. Anschließend können diese Daten geclustert werden.

Für Massen-RNA-Seq werden differentiell exprimierte Gene (DEGs) ausgewählt und dann wird eine gepaarte Analyse im Rahmen der empirischen Analyse von DEGs in der R (edgeR)-Software durchgeführt, um signifikant unterschiedliche auszuwählen (p < 0,05). DEG. Dies ist ein etablierter und gut standardisierter Ansatz. Auswahlkriterien für die weitere Analyse sind „Fold Charge“ (FC) > 1,5 und „Reads Per Kilobase of Transcript Per Million Mapped Reads“ (RPKM) > 10. Schließlich werden biologische Prozesse von www.pantherdb.org auf Basis von DEGs definiert. Es wird auch eine Substation interner Kontrollen aus experimentellen Daten durchgeführt, gefolgt von einer Clusterung von Patienten, die DEGs verwenden. Beide Ansätze führen zu ähnlichen Ergebnissen. Power-Analyse basierend auf vorläufigen Ergebnissen von Hautbiopsien zeigte, dass 19 gepaarte Proben 83,6 % Power mit einer Standardabweichung (SD) von 0,8 erhalten. RNA aus Muskelgewebe ist jedoch in der Regel qualitativ hochwertiger als Hautproben. Daher gehen die Forscher davon aus, dass Bulk-RNA-seq eine geringere Standardabweichung aufweisen wird und 14 gepaarte Proben pro Gruppe erfordert; dies schließt Proben nach Behandlungen ein.

Kombinierte Gen- und epigenetische Signaturplastizität auf zellulärer Ebene wird von Multiome unter Verwendung der Genomic x10-Plattform bewertet. Die Multiomanalyse wird von Genomic x10 standardisiert. Zur visuellen Darstellung wird Seurat verwendet. Die Leistungsanalyse für Multiome zeigte, dass 3-4 gepaarte Proben pro Gruppe benötigt werden. Die derzeit akzeptierte Analyse besteht darin, dass gepaarte Proben, die zu derselben Teilnehmergruppe gehören, kombiniert und mehrere t-Test-ähnliche Analysen für jeden Zellcluster gegen eine andere Gruppe durchgeführt werden.

Die IHC-Analyse konzentriert sich auf die sensorische Plastizität von Neuriten unter Verwendung von Markern für Untergruppen von sensorischen Neuronen und verwendet Lichtblattmikroskopie, um die Länge und Verzweigung von Neuriten für ganze Biopsien zu messen. Die Forscher planen auch, die Glylick-Methode zu verwenden, die stabile und homogene Antikörperkonjugate für Immunoglobin G aus mehreren Arten und Unterklassen erzeugt. Wenn möglich, wird auch Proteomik durchgeführt. FC wird verwendet, um Immun- und Gefäßzellen zu profilieren. Die Leistungsanalyse zeigte, dass für IHC und FC 8 Proben pro Gruppe benötigt werden.

Analysen klinischer Daten:

Als Signifikanzniveau wird P < 0,05 verwendet. Der Shapiro-Wilk-Test prüft die Normalität der Daten. Mittelwert (SD) oder Median (Interquartilbereich, IQR) werden je nach Normalität zur Beschreibung der Daten verwendet. Für normalverteilte und kontinuierliche Daten wird eine Varianzanalyse (ANOVA) mit wiederholten Messungen verwendet, um Unterschiede in der Behandlungswirkung mit Gruppe und Zeit als Faktoren zu analysieren. Wenn signifikante Unterschiede gefunden werden, werden diese mit dem Post-hoc-Test von Dunnet weiter analysiert. Schiefe oder ordinale Daten werden mit Friedman ANOVA für jede Gruppe separat mit dem Dunn-Test als Post-hoc-Test für Zeitunterschiede analysiert. Der Mann-Whitney-U-Test wird verwendet, um Unterschiede zwischen Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten zu analysieren, wobei die Bonferroni-Korrektur für multiples Testen verwendet wird.

Multivariate Statistiken werden verwendet, um Korrelationen zwischen signifikant veränderten Biomarkern und anderen Variablen zu identifizieren. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wird verwendet, um moderate oder starke Ausreißer zu identifizieren. Orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) wird dann verwendet, um die Gruppenmitgliedschaft unter Verwendung der Biomarker als Regressoren zu regressieren. Für Korrelationen zwischen Biomarkern und klinischen Variablen wird eine OPLS-Modellierung durchgeführt. Der Variable Influence on Projection (VIP)-Wert gibt die Relevanz jeder X-Variablen gepoolt über alle Dimensionen an, und die Y-Variablen geben die Gruppe von Variablen an, die Y am besten erklären. VIP > 1,0 wird als signifikant betrachtet. R2 beschreibt die Güte der Anpassung, d. h. den Bruchteil der Summe der Quadrate aller Variablen, die durch eine Hauptkomponente erklärt werden, während Q2 die Güte der Vorhersage beschreibt, d. h. den Bruchteil der Gesamtvariation der Variablen, der von einer Hauptkomponente vorhergesagt werden kann Komponente mit Kreuzvalidierungsmethoden. R2 sollte nicht wesentlich höher als Q2 sein, wenn wesentlich höher (>0,3), ist die Robustheit des Modells schlecht. Um das Modell zu validieren, wird eine erhaltene kreuzvalidierte Varianzanalyse (CV-ANOVA) p-Wert verwendet. Das OPLS-DA-Modell wird als signifikant wichtig angesehen, wenn die CV-ANOVA einen p-Wert < 0,05 hat.