Perifere TMD-pijnmechanismen en het effect van botulinetoxine A

Patiëntenwerving:

De patiënten zullen worden gerekruteerd uit degenen die zijn doorverwezen naar de gespecialiseerde kliniek voor orofaciale pijn en kaakfunctie aan de tandheelkundige kliniek van de universiteit, Karolinska Institutet, Huddinge, Zweden, of via advertenties.

Randomisatie:

Patiënten worden willekeurig toegewezen aan de behandeling door een willekeurige generator (www.randomization.com). Voor elke deelnemer wordt de behandeling op een briefje geschreven en in een verzegelde envelop gedaan door een onderzoeker die niet betrokken is bij enig ander onderdeel van de gegevensverzameling. Een tweede persoon die niet betrokken is bij het onderzoek van de patiënt zal de envelop openen, de spuit met de gerandomiseerde oplossing klaarmaken en in de onderzoekskamer plaatsen voordat de onderzoeker en de patiënt erin gaan. Botulinumtoxine en zoutoplossing zien er identiek uit, dus de deelnemer en de onderzoeker worden gemaskeerd voor de behandelingsopdracht.

Procedure:

De deelnemers vullen vóór het eerste bezoek een uitgebreide en licht gewijzigde versie van de Zweedse As II-vragenlijst in, die is opgenomen in de diagnostische criteria voor TMD (DC/TMD). De Axis II-vragenlijst bevat sociodemografische vragen, vragen over TMD-symptomen en hoofdpijn (aanwezigheid, duur en frequentie) die worden gebruikt voor diagnostische doeleinden (Symptom Questionnaire), en gevalideerde instrumenten om de fysieke en emotionele functie te beoordelen. Vervolgens wordt een klinisch onderzoek uitgevoerd volgens de DC/TMD-as I, die ook opnames omvat van de drukpijndrempel, temporele sommatiepijn en geconditioneerde pijnmodulatie. Na te hebben gecontroleerd of de deelnemer aan de in aanmerking komende criteria voldoet, worden biopsieën verkregen van een pijnlijke en een niet-pijnlijke plaats voor latere analyse. Minimaal een week hierna wordt de behandeling gegeven.

Biopsieën:

Er worden microbiopten genomen van de kauwspier en de voorste tibialis-spier (een niet-behandelde pijnvrije interne controle). De microbiopten worden door de huid genomen en bedekken het meest prominente deel van de spier onder anesthesie van het huidoppervlak. Er wordt een wegwerpbaar biopsie-instrument gebruikt met een penetratiediepte van 11 mm en een diameter van 18 gauche (G) (masseter) of 16G (tibialis). Het biopsie-instrument wordt geleid met een coaxiale naald, die tot een diepte van 10 mm wordt ingebracht. Van elke spier worden drie tot vier microbiopten genomen om ervoor te zorgen dat er voldoende spierweefsel wordt verkregen. De coaxiale naald wordt langs de lengteas van de spieren ingebracht totdat de fascia is gepenetreerd en het biopsie-instrument wordt vervolgens door de coaxiale naald ingebracht en een stuk van de spier met een afmeting van ongeveer 0,12 cm * 1,1 cm wordt verzameld. Het spiergedeelte wordt met een steriele sonde uit het biopsie-instrument verwijderd en onmiddellijk in een cryobuis geplaatst die snel wordt ingevroren in vloeibare stikstof. Na verwijdering van het spiergedeelte wordt het biopsie-instrument gespoeld met isotone zoutoplossing. Deze procedure wordt twee tot drie keer herhaald. Telkens wordt het biopsie-instrument 45° gedraaid, zodat de microbiopsie uit een nieuw deel van de spier wordt genomen. De biopsieën worden tot analyse bewaard (-80º) in de tandheelkundige biobank van Karolinska Institutet.

Analyses van biopsieën:

De biopsieën zullen worden geanalyseerd met bulk ribonucleïnezuursequencing (RNA-seq), Multiome (gecombineerde eencellige assay voor transposase-toegankelijke chromatine (ATAC) en RNA-seq), immunohistochemie (IHC), lichtvelmicroscopie en flowcytometrie ( FC) aan het Health Science Center van de Universiteit van Texas in San Antonio (UTHSCSA) en aan de Live Cell Imaging Facility aan het Karolinska Institutet, Huddinge, Zweden. De gegevens van de niet-pijnlijke plaats (tibialis anterior) worden voor elke patiënt afgetrokken van de gegevens van de pijnlijke plaats (masseter). Vervolgens kunnen deze gegevens worden geclusterd.

Voor bulk RNA seq zullen differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) worden geselecteerd en vervolgens zal gepaarde analyse worden uitgevoerd binnen empirische analyse van DEG's in R (edgeR) software om significant verschillende (p<0,05) te selecteren DEG's. Dit is een gevestigde en goed gestandaardiseerde aanpak. Selectiecriteria voor verdere analyse zijn fold charge (FC)>1,5 en Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads (RPKM)>10. Ten slotte zullen biologische processen worden gedefinieerd door www.pantherdb.org op basis van DEG's. Substation van interne controles van experimentele gegevens zal ook worden gedaan, gevolgd door clustering van patiënten met behulp van DEG's. Beide benaderingen leveren vergelijkbare resultaten op. Vermogensanalyse op basis van voorlopige resultaten van huidbiopten toonde aan dat 19 gepaarde monsters 83,6% vermogen zullen verkrijgen met een standaarddeviatie (SD) van 0,8. RNA uit spierweefsel is echter meestal van hogere kwaliteit dan huidmonsters. Daarom verwachten de onderzoekers dat bulk-RNA-seq een kleinere SD zal hebben en 14 gepaarde monsters per groep nodig heeft; dit is inclusief monsters na behandelingen.

Gecombineerde plasticiteit van genen en epigenetische kenmerken op cellulair niveau zal door Multiome worden geëvalueerd met behulp van het Genomic x10-platform. Multiome-analyse is gestandaardiseerd door Genomic x10. Voor visuele presentatie zal Seurat worden gebruikt. Poweranalyse voor Multiome toonde aan dat er 3-4 gepaarde monsters per groep nodig zijn. De momenteel geaccepteerde analyse is dat gepaarde monsters die tot dezelfde deelnemersgroep behoren, worden gecombineerd en dat meerdere t-testachtige analyses voor elke celcluster tegen een andere groep worden uitgevoerd.

De IHC-analyse zal zich richten op plasticiteit van sensorische neurieten met behulp van markers voor subsets van sensorische neuronen en Light Sheet-microscopie gebruiken om de lengte en vertakking van neurieten voor hele biopsieën te meten. De onderzoekers zijn ook van plan om de Glyclick-methode te gebruiken die stabiele en homogene antilichaamconjugaten genereert voor immunoglobine G van verschillende soorten en subklassen. Indien mogelijk zal ook aan proteomics worden gedaan. FC zal worden gebruikt om immuun- en vasculatuurcellen te profileren. Poweranalyse toonde aan dat er 8 monsters per groep nodig zijn voor IHC en FC.

Analyses van klinische gegevens:

P<0,05 wordt gebruikt als significantieniveau. De Shapiro-Wilk-test zal testen op normaliteit van gegevens. Gemiddelde (SD) of mediaan (interkwartielbereik, IQR), afhankelijk van normaliteit, zal worden gebruikt om de gegevens te beschrijven. Voor normaal verdeelde en continue gegevens wordt herhaalde metingen Variantieanalyse (ANOVA) gebruikt om verschillen in behandelingseffect te analyseren met Groep en Tijd als factoren. Als er significante verschillen worden gevonden, zullen deze verder worden geanalyseerd met de posthoctest van Dunnet. Gegevens die scheef of ordinaal zijn, worden geanalyseerd met Friedman ANOVA voor elke groep afzonderlijk met Dunn's test als posthoc test voor tijdsverschillen. De Mann-Whitney U-test zal worden gebruikt om verschillen tussen groepen op verschillende tijdstippen te analyseren, met behulp van Bonferroni-correctie voor meervoudige tests.

Multivariate statistieken zullen worden gebruikt om correlaties tussen significant gewijzigde biomarkers en andere variabelen te identificeren. Principale componentenanalyse (PCA) zal worden gebruikt om matige of sterke uitschieters te identificeren. Orthogonale partiële kleinste kwadraten discriminantanalyse (OPLS-DA) zal vervolgens worden gebruikt om groepslidmaatschap terug te dringen met behulp van de biomarkers als regressors. Voor correlaties tussen biomarkers en klinische variabelen zal OPLS-modellering worden uitgevoerd. De waarde Variabele invloed op projectie (VIP) geeft de relevantie aan van elke X-variabele gepoold over alle dimensies en de Y-variabelen geven de groep variabelen aan die Y het best verklaren. VIP > 1,0 wordt als significant beschouwd. R2 beschrijft de goedheid van fit, d.w.z. de fractie van de som van de kwadraten van alle variabelen verklaard door een hoofdcomponent, terwijl Q2 de goedheid van voorspelling beschrijft, d.w.z. de fractie van de totale variatie van de variabelen die kan worden voorspeld door een hoofdcomponent component met behulp van kruisvalidatiemethoden. R2 mag niet aanzienlijk hoger zijn dan Q2, indien substantieel hoger (>0,3) is de robuustheid van het model slecht. Om het model te valideren, zal een verkregen cross-gevalideerde variantieanalyse (CV-ANOVA) p-waarde worden gebruikt. Het OPLS-DA-model wordt van significant belang geacht als de CV-ANOVA een p-waarde < 0,05 heeft.