Mecanismos de dolor periférico TMD y el efecto de la toxina botulínica A

Reclutamiento de pacientes:

Los pacientes serán reclutados entre aquellos referidos a la Clínica Especializada en Dolor Orofacial y Función Mandibular en la Clínica Dental Universitaria, Karolinska Institutet, Huddinge, Suecia, o mediante publicidad.

Aleatorización:

Los pacientes serán asignados al azar al tratamiento por un generador aleatorio (www.randomization.com). Para cada participante, el tratamiento se escribirá en una nota y se colocará en un sobre sellado por un investigador que no participe en ninguna otra parte de la recopilación de datos. Una segunda persona que no participe en el examen del paciente abrirá el sobre, preparará la jeringa con la solución aleatoria y la colocará en la sala de examen antes de que entren el examinador y el paciente. La toxina botulínica y la solución salina tienen una apariencia idéntica, por lo que el participante y el investigador no verán la asignación del tratamiento.

Procedimiento:

Los participantes completan una versión ampliada y ligeramente modificada del cuestionario sueco Axis II incluido en los Criterios de diagnóstico para TMD (DC/TMD) antes de la primera visita. El cuestionario del Eje II contiene preguntas sociodemográficas, preguntas sobre síntomas de TTM y dolor de cabeza (presencia, duración y frecuencia) utilizadas con fines diagnósticos (Cuestionario de síntomas) e instrumentos validados para evaluar la función física y emocional. A continuación, se realiza un examen clínico de acuerdo con el Eje I de DC/TMD, que también incluye registros del umbral del dolor a la presión, el dolor de suma temporal y la modulación del dolor condicionado. Después de asegurarse de que el participante cumple con los criterios elegibles, se obtienen biopsias de un sitio doloroso y no doloroso para su posterior análisis. Al menos una semana después se da tratamiento.

Biopsias:

Se obtendrán microbiopsias del músculo masetero y tibial anterior (un control interno sin dolor no tratado). Las microbiopsias se toman a través de la piel que recubre la parte más prominente del músculo bajo anestesia superficial de la piel. Se utilizará un instrumento de biopsia desechable con una profundidad de penetración de 11 mm y un diámetro de 18 gauche (G) (masetero) o 16G (tibial). El instrumento de biopsia se guiará con una aguja coaxial, que se introducirá a una profundidad de 10 mm. Se tomarán de tres a cuatro microbiopsias de cada músculo para asegurar que se obtenga suficiente tejido muscular. La aguja coaxial se insertará a lo largo del eje largo de los músculos hasta penetrar la fascia y luego se insertará el instrumento de biopsia a través de la aguja coaxial y se recolectará una porción del músculo con un tamaño de aproximadamente 0,12 cm * 1,1 cm. La sección de músculo se extraerá del instrumento de biopsia con una sonda estéril y se colocará inmediatamente en un criotubo que se congelará instantáneamente en nitrógeno líquido. Después de retirar la sección de músculo, el instrumento de biopsia se enjuagará con solución salina isotónica. Este procedimiento se repetirá dos o tres veces. Cada vez, el instrumento de biopsia se rotará 45° para que la microbiopsia se tome de una nueva porción del músculo. Las biopsias se almacenarán (-80º) en el biobanco dental del Karolinska Institutet hasta su análisis.

Análisis de biopsias:

Las biopsias se analizarán con secuenciación de ácido ribonucleico a granel (RNA-seq), multioma (ensayo combinado de una sola célula para la cromatina accesible por transposasa (ATAC) y RNA-seq), inmunohistoquímica (IHC), microscopía de hoja de luz y citometría de flujo ( FC) en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio (UTHSCSA) y en el Centro de Imágenes de Células Vivas en el Instituto Karolinska, Huddinge, Suecia. Los datos del sitio no doloroso (tibialis anterior) se restarán de los datos del sitio doloroso (masetero) para cada paciente. Luego, estos datos se pueden agrupar.

Para la secuenciación de ARN a granel, se seleccionarán genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y luego se ejecutará un análisis emparejado dentro del análisis empírico de DEG en el software R (edgeR) para seleccionar significativamente diferentes (p <0.05) DEG. Este es un enfoque establecido y bien estandarizado. Los criterios de selección para un análisis posterior son carga de pliegue (FC)> 1,5 y lecturas por kilobase de transcripción por millón de lecturas asignadas (RPKM)> 10. Finalmente, los procesos biológicos serán definidos por www.pantherdb.org sobre la base de DEG. También se realizará una subestación de controles internos a partir de datos experimentales, seguida de un agrupamiento de pacientes mediante DEG. Ambos enfoques producen resultados similares. El análisis de potencia basado en los resultados preliminares de las biopsias de piel mostró que 19 muestras pareadas obtendrán una potencia del 83,6 % con una desviación estándar (DE) de 0,8. Sin embargo, el ARN del tejido muscular suele ser de mayor calidad que las muestras de piel. Por lo tanto, los investigadores anticipan que el RNA-seq a granel tendrá una SD menor y requerirá 14 muestras pareadas por grupo; esto incluye muestras después de los tratamientos.

Multiome evaluará la plasticidad combinada de genes y firmas epigenéticas a nivel celular utilizando la plataforma Genomic x10. El análisis de multiomas está estandarizado por Genomic x10. Para la presentación visual se utilizará Seurat. El análisis de poder para Multiome mostró que se necesitan 3-4 muestras emparejadas por grupo. El análisis actualmente aceptado es que las muestras pareadas pertenecientes al mismo grupo de participantes se combinaron y múltiples análisis similares a la prueba t para cada grupo de células se compararon con otro grupo.

El análisis IHC se centrará en la plasticidad de las neuritas sensoriales usando marcadores para subconjuntos de neuronas sensoriales y usará la microscopía Light Sheet para medir la longitud y la ramificación de las neuritas para biopsias completas. Los investigadores también tienen previsto utilizar el método Glyclick, que genera conjugados de anticuerpos homogéneos y estables para la inmunoglobina G de varias especies y subclases. Si es posible, también se realizará proteómica. FC se utilizará para perfilar células inmunitarias y vasculares. El análisis de potencia mostró que se necesitarán 8 muestras por grupo para IHC y FC.

Análisis de datos clínicos:

P<0,05 se utilizará como nivel de significación. La prueba de Shapiro-Wilk comprobará la normalidad de los datos. Se utilizará la media (DE) o la mediana (rango intercuartílico, IQR), según la normalidad, para describir los datos. Para datos continuos y normalmente distribuidos, se utilizará el análisis de varianza (ANOVA) de medidas repetidas para analizar las diferencias en el efecto del tratamiento con el grupo y el tiempo como factores. Si se encuentran diferencias significativas, se analizarán más a fondo con la prueba posthoc de Dunnet. Los datos asimétricos u ordinales se analizarán con ANOVA de Friedman para cada grupo por separado con la prueba de Dunn como prueba post hoc para las diferencias de tiempo. La prueba U de Mann-Whitney se utilizará para analizar las diferencias entre los grupos en diferentes momentos, utilizando la corrección de Bonferroni para pruebas múltiples.

Se utilizarán estadísticas multivariadas para identificar correlaciones entre biomarcadores significativamente modificados y otras variables. Se utilizará el análisis de componentes principales (PCA) para identificar valores atípicos moderados o fuertes. A continuación, se utilizará el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) para hacer una regresión de la pertenencia al grupo utilizando los biomarcadores como regresores. Para las correlaciones entre biomarcadores y variables clínicas se realizará el modelado OPLS. El valor Variable Influence on Projection (VIP) indica la relevancia de cada variable X agrupada en todas las dimensiones y las variables Y indican el grupo de variables que mejor explican Y. VIP > 1,0 se considera significativo. R2 describe la bondad de ajuste, es decir, la fracción de la suma de los cuadrados de todas las variables explicadas por un componente principal, mientras que Q2 describe la bondad de la predicción, es decir, la fracción de la variación total de las variables que puede ser predicha por un componente principal. componente utilizando métodos de validación cruzada. R2 no debería ser considerablemente más alto que Q2, si es sustancialmente más alto (>0.3), la robustez del modelo es pobre. Para validar el modelo, se utilizará un valor de p de análisis de varianza (CV-ANOVA) con validación cruzada obtenido. El modelo OPLS-DA se considera de importancia significativa si el CV-ANOVA tiene un valor de p < 0,05.