Obwodowe mechanizmy bólu TMD i wpływ toksyny botulinowej A

Rekrutacja pacjentów:

Pacjenci będą rekrutowani spośród osób kierowanych do Specjalistycznej Kliniki Bólu Twarzy i Funkcji Szczęki Uniwersyteckiej Kliniki Stomatologicznej, Karolinska Institutet, Huddinge, Szwecja, lub poprzez ogłoszenie.

Randomizacja:

Pacjenci zostaną losowo przydzieleni do leczenia przez generator losowy (www.randomization.com). Dla każdego uczestnika leczenie zostanie zapisane na notatce i umieszczone w zapieczętowanej kopercie przez badacza niezaangażowanego w żadną inną część zbierania danych. Druga osoba niezaangażowana w badanie pacjenta otworzy kopertę, przygotuje strzykawkę z randomizowanym roztworem i umieści ją w gabinecie przed wejściem badającego i pacjenta. Toksyna botulinowa i sól fizjologiczna mają identyczny wygląd, więc uczestnik i badacz będą zamaskowani podczas przydziału do zabiegu.

Procedura:

Przed pierwszą wizytą uczestnicy wypełniają rozszerzoną i nieco zmodyfikowaną wersję szwedzkiego kwestionariusza Osi II zawartego w Kryteriach diagnostycznych dla TMD (DC/TMD). Kwestionariusz Osi II zawiera pytania socjodemograficzne, pytania dotyczące objawów TMD i bólu głowy (obecność, czas trwania i częstotliwość) wykorzystywane do celów diagnostycznych (Kwestionariusz Objawowy) oraz zwalidowane narzędzia do oceny funkcji fizycznych i emocjonalnych. Następnie przeprowadza się badanie kliniczne zgodnie z osią I DC/TMD, które obejmuje również rejestrację progu bólu uciskowego, bólu sumującego czasowo i warunkowej modulacji bólu. Po upewnieniu się, że uczestnik spełnia kryteria kwalifikacyjne, pobierane są biopsje z bolesnego i niebolesnego miejsca do późniejszej analizy. Co najmniej tydzień później podaje się leczenie.

Biopsje:

Mikrobiopsje zostaną pobrane z mięśnia żwacza i mięśnia piszczelowego przedniego (nieleczona, bezbolesna kontrola wewnętrzna). Mikrobiopsje są pobierane przez skórę pokrywającą najbardziej widoczną część mięśnia pod znieczuleniem powierzchniowym skóry. Zostanie użyte jednorazowe narzędzie do biopsji o głębokości penetracji 11 mm i średnicy 18 gauche (G) (żwacz) lub 16G (piszczel). Instrument do biopsji będzie prowadzony współosiową igłą, która zostanie wprowadzona na głębokość 10 mm. Z każdego mięśnia zostaną pobrane od trzech do czterech mikrobiopsji, aby upewnić się, że uzyskano wystarczającą ilość tkanki mięśniowej. Igła współosiowa zostanie wprowadzona wzdłuż długiej osi mięśni aż do penetracji powięzi, a następnie narzędzie do biopsji zostanie wprowadzone przez igłę współosiową i pobrany zostanie kawałek mięśnia o wielkości około 0,12 cm * 1,1 cm. Sekcja mięśnia zostanie usunięta z instrumentu do biopsji za pomocą sterylnej sondy i natychmiast umieszczona w krioprobówce, która zostanie szybko zamrożona w ciekłym azocie. Po usunięciu skrawka mięśnia narzędzie do biopsji zostanie przepłukane izotonicznym roztworem soli fizjologicznej. Ta procedura zostanie powtórzona dwa do trzech razy. Za każdym razem instrument do biopsji zostanie obrócony o 45°, tak aby mikrobiopsja została pobrana z nowej części mięśnia. Biopsje będą przechowywane (-80º) w biobanku dentystycznym Karolinska Institutet do czasu analizy.

Analizy biopsji:

Biopsje będą analizowane za pomocą masowego sekwencjonowania kwasu rybonukleinowego (RNA-seq), Multiome (połączony test jednokomórkowy dla chromatyny dostępnej dla transpozazy (ATAC) i RNA-seq), immunohistochemii (IHC), mikroskopii z lekkim arkuszem i cytometrii przepływowej ( FC) w University of Texas Health Science Center w San Antonio (UTHSCSA) oraz w Live Cell Imaging Facility w Karolinska Institutet, Huddinge, Szwecja. Dane miejsca niebolesnego (mięsień piszczelowy przedni zostanie odjęty od danych miejsca bolesnego (żwacz) dla każdego pacjenta. Następnie dane te można grupować.

W przypadku masowej sekwencji RNA zostaną wybrane geny o różnej ekspresji (DEG), a następnie zostanie przeprowadzona analiza par w ramach analizy empirycznej DEG w oprogramowaniu R (edgeR) w celu wybrania istotnie różnych (p <0, 05) DEG. Jest to ugruntowane i dobrze wystandaryzowane podejście. Kryteria wyboru do dalszej analizy to ładunek krotności (FC)>1,5 i odczyty na kilozasadę transkryptu na milion zmapowanych odczytów (RPKM)>10. Wreszcie, procesy biologiczne zostaną zdefiniowane przez www.pantherdb.org na podstawie DEG. Przeprowadzona zostanie również podstacja kontroli wewnętrznych z danych eksperymentalnych, a następnie grupowanie pacjentów przy użyciu DEG. Oba podejścia dają podobne wyniki. Analiza mocy oparta na wstępnych wynikach biopsji skóry wykazała, że ​​19 sparowanych próbek uzyska moc 83,6% przy odchyleniu standardowym (SD) równym 0,8. Jednak RNA z tkanki mięśniowej jest zwykle lepszej jakości niż próbki skóry. W związku z tym badacze przewidują, że sekwencja RNA w masie będzie miała mniejsze SD i będzie wymagać 14 sparowanych próbek na grupę; obejmuje to próbki po zabiegach.

Połączona plastyczność genów i sygnatur epigenetycznych na poziomie komórkowym zostanie oceniona przez Multiome przy użyciu platformy Genomic x10. Analiza wielomianowa jest standaryzowana przez Genomic x10. Do prezentacji wizualnej zostanie wykorzystany Seurat. Analiza mocy dla Multiome wykazała, że ​​potrzebne są 3-4 sparowane próbki na grupę. Obecnie akceptowana analiza polega na tym, że połączone sparowane próbki należące do tej samej grupy uczestników i wiele analiz podobnych do testu t dla każdego skupiska komórek są porównywane z inną grupą.

Analiza IHC skupi się na plastyczności neurytów czuciowych przy użyciu markerów dla podzbiorów neuronów czuciowych i wykorzysta mikroskopię Light Sheet do pomiaru długości i rozgałęzień neurytów dla całych biopsji. Badacze planują również zastosowanie metody Glyclick, która generuje stabilne i homogenne koniugaty przeciwciał dla immunoglobiny G z kilku gatunków i podklas. Jeśli to możliwe, zostanie wykonana również proteomika. FC zostanie wykorzystany do profilowania komórek odpornościowych i układu naczyniowego. Analiza mocy wykazała, że ​​do IHC i FC potrzebnych będzie 8 próbek na grupę.

Analizy danych klinicznych:

P<0,05 zostanie użyty jako poziom istotności. Test Shapiro-Wilka sprawdzi normalność danych. Do opisu danych wykorzystana zostanie średnia (SD) lub mediana (rozstęp międzykwartylowy, IQR), w zależności od normalności. W przypadku danych o rozkładzie normalnym i danych ciągłych, analiza wariancji (ANOVA) zostanie wykorzystana do analizy różnic w efekcie leczenia z grupą i czasem jako czynnikami. Jeśli zostaną znalezione znaczące różnice, zostaną one dalej przeanalizowane za pomocą testu posthoc Dunneta. Dane, które są skośne lub porządkowe, będą analizowane za pomocą ANOVA Friedmana dla każdej grupy oddzielnie z testem Dunna jako testem posthoc dla różnic czasowych. Test U Manna-Whitneya zostanie wykorzystany do analizy różnic między grupami w różnych punktach czasowych, przy użyciu poprawki Bonferroniego do testów wielokrotnych.

Statystyki wielowymiarowe zostaną wykorzystane do zidentyfikowania korelacji między znacznie zmienionymi biomarkerami a innymi zmiennymi. Analiza głównych składowych (PCA) zostanie wykorzystana do zidentyfikowania umiarkowanych lub silnych wartości odstających. Ortogonalna analiza dyskryminacyjna cząstkowych najmniejszych kwadratów (OPLS-DA) zostanie następnie wykorzystana do regresji członkostwa w grupie przy użyciu biomarkerów jako regresorów. Dla korelacji między biomarkerami a zmiennymi klinicznymi zostanie przeprowadzone modelowanie OPLS. Wartość wpływu zmiennej na projekcję (VIP) wskazuje istotność każdej zmiennej X zebranej we wszystkich wymiarach, a zmienne Y wskazują grupę zmiennych, które najlepiej wyjaśniają Y. VIP > 1,0 uważa się za istotne. R2 opisuje dobroć dopasowania, tj. ułamek sumy kwadratów wszystkich zmiennych wyjaśnionych przez główną składową, podczas gdy Q2 opisuje dobroć predykcji, tj. ułamek całkowitej zmienności zmiennych, które można przewidzieć przez główną komponent przy użyciu metod walidacji krzyżowej. R2 nie powinien być znacznie wyższy niż Q2, jeśli jest znacznie wyższy (>0,3), odporność modelu jest słaba. W celu walidacji modelu zostanie wykorzystana uzyskana wartość p z walidacji krzyżowej analizy wariancji (CV-ANOVA). Uważa się, że model OPLS-DA ma istotne znaczenie, jeśli CV-ANOVA ma wartość p < 0,05.