Perifere TMD-smertemekanismer og virkningen af ​​botulinumtoksin A

Patientrekruttering:

Patienterne vil blive rekrutteret blandt dem, der henvises til Specialistklinikken for Orofacial Smerter og Kæbefunktion på Universitetstandklinikken, Karolinska Institutet, Huddinge, Sverige, eller via annonce.

Randomisering:

Patienter vil blive tilfældigt tildelt behandling af en tilfældig generator (www.randomization.com). For hver deltager vil behandlingen blive skrevet på en seddel og lagt i en lukket kuvert af en forsker, der ikke er involveret i nogen anden del af dataindsamlingen. En anden person, der ikke er involveret i patientundersøgelse, åbner kuverten, klargør sprøjten med den randomiserede opløsning og placerer den i undersøgelsesrummet, før undersøgeren og patienten går ind i den. Botulinumtoksin og saltvand har identisk udseende, så deltageren og efterforskeren vil blive maskeret til behandlingsopgaven.

Procedure:

Deltagerne udfylder en udvidet og let modificeret version af det svenske Axis II-spørgeskema inkluderet i Diagnostic Criteria for TMD (DC/TMD) før det første besøg. Axis II-spørgeskemaet indeholder sociodemografiske spørgsmål, spørgsmål vedrørende TMD-symptomer og hovedpine (tilstedeværelse, varighed og hyppighed), der bruges til diagnostiske formål (Symptom Questionnaire), og validerede instrumenter til at vurdere fysisk og følelsesmæssig funktion. Der udføres derefter en klinisk undersøgelse i henhold til DC/TMD Axis I, som også omfatter registreringer af tryksmertetærskel, temporal summationssmerte og betinget smertemodulation. Efter at have sikret sig, at deltageren opfylder de berettigede kriterier, udtages biopsier fra et smertefuldt og et ikke-smertefuldt sted til senere analyse. Mindst en uge herefter gives behandling.

Biopsier:

Mikrobiopsier vil blive opnået fra tyggemuskel og anterior tibialis muskel (en ubehandlet smertefri intern kontrol). Mikrobiopsierne tages gennem huden, der ligger over den mest fremtrædende del af musklen under hudoverfladebedøvelse. Der vil blive brugt et engangsbiopsiinstrument med en penetrationsdybde på 11 mm og en diameter på 18 gauche (G) (masseter) eller 16G (tibialis). Biopsiinstrumentet vil blive styret med en koaksial nål, der indsættes i en dybde på 10 mm. Der vil blive taget tre til fire mikrobiopsier fra hver muskel for at sikre, at der opnås tilstrækkeligt muskelvæv. Koaksialnålen indsættes langs musklernes lange akse, indtil fascien er penetreret, og biopsiinstrumentet indsættes derefter gennem koaksialnålen og et stykke af musklen med en størrelse på ca. 0,12 cm * 1,1 cm opsamles. Muskelsektionen fjernes fra biopsiinstrumentet ved hjælp af en steril probe og anbringes straks i et kryorør, som lynfryses i flydende nitrogen. Efter fjernelse af muskelsektionen vil biopsiinstrumentet blive skyllet med isotonisk saltvand. Denne procedure vil blive gentaget to til tre gange. Hver gang vil biopsiinstrumentet blive roteret 45°, så mikrobiopsien tages fra en ny del af musklen. Biopsierne vil blive opbevaret (-80º) i Karolinska Institutets tandbiobank indtil analyse.

Analyser af biopsier:

Biopsierne vil blive analyseret med bulk ribonukleinsyresekventering (RNA-seq), Multiome (kombineret enkeltcelleanalyse for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) og RNA-seq), immunhistokemi (IHC), lysarkmikroskopi og flowcytometri ( FC) ved University of Texas Health Science Center i San Antonio (UTHSCSA) og på Live Cell Imaging Facility på Karolinska Institutet, Huddinge, Sverige. Data for det ikke-smertefulde sted (anterior tibialis vil blive trukket fra data for det smertefulde sted (masseter) for hver patient. Derefter kan disse data grupperes.

For bulk RNA-seq vil differentielt udtrykte gener (DEG'er) blive udvalgt, og derefter vil parret analyse blive kørt inden for empirisk analyse af DEG'er i R (edgeR) software for at vælge signifikant forskellige (p<0,05) DEGs. Dette er en etableret og velstandardiseret tilgang. Udvælgelseskriterier for yderligere analyse er fold charge (FC)>1,5 og Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads (RPKM)>10. Endelig vil biologiske processer blive defineret af www.pantherdb.org på basis af DEG'er. Substation af interne kontroller fra eksperimentelle data vil også blive udført, efterfulgt af gruppering af patienter ved hjælp af DEG'er. Begge tilgange giver lignende resultater. Effektanalyse baseret på foreløbige resultater fra hudbiopsier viste, at 19 parrede prøver vil opnå 83,6 % effekt med en standardafvigelse (SD) på 0,8. Imidlertid er RNA fra muskelvæv normalt af højere kvalitet end hudprøver. Derfor forudser efterforskerne, at RNA-seq i bulk vil have mindre SD og kræve 14 parrede prøver pr. gruppe; dette inkluderer prøver efter behandlinger.

Kombineret gen og epigenetisk signaturplasticitet på cellulære niveauer vil blive evalueret af Multiome ved hjælp af Genomic x10 platform. Multiomanalyse er standardiseret af Genomic x10. Til visuel præsentation vil Seurat blive brugt. Effektanalyse for Multiome viste, at 3-4 parrede prøver pr. gruppe er nødvendige. Aktuelt accepteret analyse er, at parrede prøver, der tilhører den samme deltagergruppe, kombineret og multiple t-test-lignende analyser for hver celleklynge køres mod en anden gruppe.

IHC-analysen vil fokusere på sensorisk neuritplasticitet ved hjælp af markører for undergrupper af sensoriske neuroner og bruge Light Sheet-mikroskopi til at måle neuritlængde og forgrening for hele biopsier. Forskerne planlægger også at bruge Glyclick-metoden, som genererer stabile og homogene antistofkonjugater for immunglobin G fra flere arter og underklasser. Hvis det er muligt, vil der også blive lavet proteomics. FC vil blive brugt til at profilere immun- og vaskulaturceller. Effektanalyse viste, at 8 prøver pr. gruppe vil være nødvendige for IHC og FC.

Analyser af kliniske data:

P<0,05 vil blive brugt som signifikansniveau. Shapiro-Wilks test vil teste for normaliteten af ​​data. Middelværdi (SD) eller median (interkvartilområde, IQR), afhængigt af normalitet, vil blive brugt til at beskrive dataene. For normalfordelte og kontinuerlige data vil gentagne mål blive anvendt Variansanalyse (ANOVA) til at analysere forskelle i behandlingseffekt med Gruppe og Tid som faktorer. Hvis der findes signifikante forskelle, vil disse blive analyseret yderligere med Dunnets posthoc test. Data, der er skæve eller ordinale, vil blive analyseret med Friedman ANOVA for hver gruppe separat med Dunns test som posthoc test for tidsforskelle. Mann-Whitney U-testen vil blive brugt til at analysere forskelle mellem grupper på forskellige tidspunkter ved at bruge Bonferroni-korrektion til flere test.

Multivariat statistik vil blive brugt til at identificere sammenhænge mellem væsentligt ændrede biomarkører og andre variable. Principal komponent analyse (PCA) vil blive brugt til at identificere moderate eller stærke outliers. Ortogonal partial mindste kvadraters diskriminantanalyse (OPLS-DA) vil derefter blive brugt til at regressere gruppemedlemskab ved at bruge biomarkørerne som regressorer. For korrelationer mellem biomarkører og kliniske variabler vil OPLS-modellering blive udført. Variable Influence on Projection-værdien (VIP) angiver relevansen af ​​hver X-variabel samlet over alle dimensioner, og Y-variablerne angiver den gruppe af variabler, der bedst forklarer Y. VIP > 1,0 anses for at være signifikant. R2 beskriver godheden af ​​tilpasning, dvs. brøkdelen af ​​summen af ​​kvadrater af alle variabler forklaret af en hovedkomponent, mens Q2 beskriver godheden af ​​forudsigelse, dvs. den brøkdel af den samlede variation af variablerne, der kan forudsiges af en principal komponent ved hjælp af krydsvalideringsmetoder. R2 bør ikke være væsentligt højere end Q2, hvis væsentligt højere (>0,3) er robustheden af ​​modellen dårlig. For at validere modellen vil en opnået krydsvalideret variansanalyse (CV-ANOVA) p-værdi blive brugt. OPLS-DA modellen anses for at være af væsentlig betydning, hvis CV-ANOVA har en p-værdi < 0,05.