ベトナムのホーチミン市における発達性およびてんかん性脳症の子供の遺伝子調査

この前向きコホート研究では、南ベトナムで最大の小児神経科施設で追跡され、連続して登録された発達性およびてんかん性脳症の子供の割合を知りたいと考えています。高度な遺伝子調査により、病原性遺伝子変異体の同定が可能になりました。 この割合は 50% になると予想されます。

また、遺伝的結果により、個別化された治療の適応と全体的な管理の変更が可能になる子供の割合も調査します。 この割合は少なくとも 10% になると予想されます。

この共同プロジェクトは、ベトナムで重度の早発性てんかんおよび発達障害を有するすべての患者に対するハイスループット遺伝子手技の臨床的有用性を実証するための第一歩です。 ベトナムとスイスでの患者のエクソーム配列の並行分析により、手順の最適化が可能になります。

患者の選択:

ベトナムの 16.745 人の子供/1000 人の出生率に基づく (2018 年の統計、data.worldbank.org、 2020 年 12 月 18 日に参照)、ベトナムの死亡率は 15.9/1,000 出生 (2019 年の統計、data.worldbank.org、 2020 年 12 月 18 日に参照)、国全体で合計 1,394,401 人の出生があり、全国人口は 97,752,966 人で、そのうち 8,602,317 人がホーチミン市に住んでいます (2020 年の統計、worldometers.info、 worldpopulationreview.org、 2020 年 12 月 18 日に相談)、毎年 122,708 から 144,046 人の子供が市内で生まれ、そのうち 120,756 から 141,756 人が生き続けると推定されます。 オーストラリアのビクトリア州で最近計算された 54/100,000 の出生率と、ベトナムの農村地域である Ba Vi での年齢調整された 44.8/100,000 人の発生率に基づいて、 HCMC では毎年 54 ～ 75 人の SEI の子供が生まれていると推定されています。 これらの子供たちの大半が ND2 でフォローされているという事実と、より広い地域から来ている重度の神経疾患を持つ多くの患者が ND2 にも相談しているという事実を考慮して、私たちの目標は年間 50 人の子供を登録することです。

包含基準：研究期間中にND2病院で治療を受けた連続した患者は、研究に参加するよう求められ、以下の包含基準をすべて満たす場合、同意書に署名するよう求められます。

1. -発症時またはフォローアップ時の薬剤耐性てんかん（ILAE 2010基準による）
2. -小児神経科医の評価によると、重度の発達遅延または退行（または正式に評価された場合、発達指数<50）
3. 主な症状（発作、発達遅滞）の発症年齢：0～36ヶ月
4. 研究に参加することに同意し、署名済みの同意書 事前に選択されたすべての患者は、血液サンプルが採取される前に、Nhi Dong 2 病院とジュネーブ大学病院の間の毎月の電話会議で議論されます。 血液サンプルは、利用可能な場合、患者とその両親から採取されます。

除外基準：特定された構造的、感染性、または炎症性の原因（周産期の低酸素性虚血性脳症、脳血管障害、外傷または脳炎の後遺症、神経皮膚障害など）を持つ患者は、研究への参加を求められません。

遺伝子調査:

これまでのことを踏まえて、WES（Whole Exome Sequencing）による遺伝子調査を開始し、原因となるバリアントが見つからない場合には、核型分析と CGH アレイを継続する予定です。 WES は、以下に説明するように、DNA 抽出、エクソーム シーケンス、処理とマッピング、バリアント コール、アノテーション、および優先順位付けを含む多段階の手順です。 WES の結果が陰性の場合、予定されている Genome Board (GB) セッションで、さらに検査を実施することの有用性が評価されます。

ゲノム DNA の抽出とエクソーム配列決定 手短に言えば、各参加者とその両親の両方について、2 ～ 5 ml の全血がサンプリングされ、K2/K3-エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 抗凝固剤でコーティングされたチューブに保存されます。 ゲノムDNAは、DNA Mini Blood Isolationキット（QIAGEN DmbH、オランダ）を使用して抽出されます。 DNA 量は、Victor 3 蛍光測定法を使用して、二本鎖 DNA を定量するための超高感度蛍光核酸染色法である Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen) によって測定され、DNA の状態は 1% ゲルによって評価されます。シーケンスステップの前に DNA サンプルの質と量を確保するための電気泳動。

Whole Exome Sequencing は、すべてのタンパク質コード領域をターゲットとし、ヒトゲノムの浸透率の高い変異の 85% を占めています。 全エクソームシーケンシングは、韓国ソウルの Macrogen Ltd. にある CLIA 認定ラボで実施されます。 構築されたライブラリは、Agilent SureSelect V5 エクソーム キャプチャ キット (Agilent Technologies、米国カリフォルニア州サンタクララ) を使用して配列決定されます。このキットは、NovaSeq で 120 mer ビオチン化 cRNA ベイトを使用してエクソーム領域 (合計 357,999 エクソン) を捕捉および濃縮します。 6000 シーケンス システム (イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)。

WES (FASTQ ファイル) によって得られた DNA 配列は、ホーチミン市とジュネーブで、「インシリコ」で並行して分析されますが、表現型の説明に基づいた追加の焦点を絞った分析の決定と同様に、互いに盲検化されます (例えば、特定の遺伝子の不十分にカバーされたいくつかのエクソンのサンガー配列決定）。 そのために、患者と親のDNAのコード化されたアリコートがジュネーブに転送されます。

生データの処理とマッピング生データは、社内のバイオインフォマティクス パイプラインを使用してホーチミン市で分析され、ジュネーブでは独自に分析されます。 FASTQ 生データの品質は、Phred スコアの割り当て、GC コンテンツ、読み取り長、読み取り品質、および配列重複レベルによって保証されます。 Trimmomatic を使用した前処理ステップを適用して、低品質の読み取りとアダプターの汚染配列を取り除きます。 BWA-MEM、PICARD、および GATK によるアルゴリズムは、マッピングおよび追加のアライメント後の処理に使用されます。これには、重複の除去やアーティファクトをマークまたは除去するための基本品質の再キャリブレーションが含まれます。

バリアントの呼び出しと注釈 洗練されたマッピング データは、GATK Haplotype Caller と ANNOVAR によるバリアントの呼び出しと注釈のためにさらに処理されます。 次に、29 のアルゴリズム、9 つの保存スコア、および 1000 Genomes、ExAC、gnomAD、NHLBI Exome シーケンス プロジェクト ESP6500 バリアントの優先順位付けなどの多くの人口データベースで観察される関連情報を含む、すべての潜在的な候補の機能予測と注釈が dbNSFP によって実行されます。 671 遺伝子の標的てんかんパネルによってフィルタリングされた疑わしい病因変異は、American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) の 2015 年の推奨に従って徹底的に分析されます。 推奨されるように、検出されたすべての候補バリアントの家族分離を検証するために、サンガー シーケンスも使用されます。 バリアントは、1) 良性、2) 良性である可能性が高い、3) 重要性が不明、4) 病原性である可能性が高い、5) 病原性である、の 5 つのカテゴリに分類されます。 dbSNP、1000 Genomes Project、ExAC、NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) のいずれかのデータベースでマイナー アレル頻度が 0.05 を超えるバリアントは除外されます。 実行される分析には、DANN、ゲノム進化率プロファイリング ++、尤度比テスト、突然変異テイスター、隠れマルコフ モデル - MKL コーディングによる機能分析、複合アノテーション依存枯渇、および EIGEN スコアの計算分析が含まれます。

大量の配列データ、限られた既知の疾患メカニズム、および遺伝的不均一性が、DEE などの多くの疾患の複雑さに寄与しています。 したがって、最終的なバリアントの解釈は、研究期間を通じて、定期的な正式なゲノム ボード (GB) セッション中に、遺伝学者、臨床医、検査技師、および生物統計学者の間の学際的な議論で行われます。

GB は、HUG Center of Genomic Medicine (CGEM) が主催する学際的なセッションであり、これまで診断を逃れてきた患者のファイルがレビューされます。 小児神経学 GB は、神経小児科医、小児放射線科医、臨床遺伝学者、生物学者、遺伝医学部門のバイオインフォマティシャン、および症例によって要求された他の専門家を集めます。 成人の神経内科医、検査医学の専門家、免疫学者、またはその他の専門家。 一緒に、彼らは病気を説明するかもしれない遺伝子の患者の遺伝的変異を見直し、それらを拒否するか、表現型の事後検証のために非常に焦点を絞った追加の調査を注文することを提案します。 診断に到達できない場合、患者は 18 ～ 24 か月後に新しい GB のためにクリニックに戻るように勧められます。 当社の社内シリーズでは、GB が 2019 年 2 月に実装されて以来、HUG が DEE の診断率を約 45% から 55% に高めることができたことが示されています。 GB は、遠隔地で医療秘密の下で患者データを安全かつ機密に交換できるように装備されたビデオ会議室で行われます。 患者の遺伝子データは議論されますが、あるセンターから別のセンターにコピーまたは転送されることはありません。 データは、対象となる WES のさまざまな遺伝子の遺伝的バリアントのリストで構成され、パブリックおよび社内データベース (GnomAD など) からの注釈と、バイオインフォマティクス ツール (CADD スコアなど) からの計算が含まれます。 通常、神経小児科医は患者の臨床データを提示し、小児放射線科医は MRI を示してコメントし、遺伝学者は候補バリアントを運ぶ臨床的に関連する遺伝子を提示し、生物学者とバイオインフォマティシャンの分子診断研究室チームが資格を取得します。バリアントは、病原性、おそらく病原性、または未知の重要性として分類されます。 後者の場合、チームは GB 中に文献をレビューし、追加の検査によって推定上の診断が確実に確認されるかどうかを判断します。つまり、これまでのところ重要性が不明であると認定されたバリアントを持つ遺伝子によって引き起こされる表現型を確認します。

当社は、2012 年以来、遺伝性疾患の臨床診断をサポートする次世代シーケンシング アプローチの専門知識を持ち、バイオインフォマティクス プラットフォームやゲノムワイド関連研究に基づくその他のトランスレーショナル SNP スクリーニングを提供しています。 チームは、ベトナムのゲノム希少疾患データベースへの貢献に強い関心を持っています。