Genetisch onderzoek bij kinderen met ontwikkelingsstoornissen en epileptische encefalopathieën in Ho Chi Minh City, Vietnam

Met deze prospectieve cohortstudie willen we weten welk deel van de kinderen met ontwikkelings- en epileptische encefalopathieën gevolgd wordt in de grootste pediatrische neurologiefaciliteit in Zuid-Vietnam en achtereenvolgens is ingeschreven voor wie geavanceerde genetische onderzoeken de identificatie van pathogene genvarianten mogelijk maken. We verwachten dat dit aandeel 50% zal zijn.

We zullen ook onderzoeken bij welk percentage van de kinderen de genetische resultaten geïndividualiseerde behandelingsaanpassingen en globale managementveranderingen mogelijk maken. We verwachten dat dit aandeel minimaal 10% zal bedragen.

Dit samenwerkingsproject is de eerste stap om het klinische nut aan te tonen van high-throughput genetische procedures voor alle patiënten met ernstige epilepsie met vroege aanvang en ontwikkelingsproblemen in Vietnam. Parallelle analyses van exome-sequenties van patiënten in Vietnam en Zwitserland zullen de optimalisatie van de procedure mogelijk maken.

Patiënt selectie:

Gebaseerd op een geboortecijfer van 16.745 kinderen/1000 mensen in Vietnam (statistieken uit 2018, data.worldbank.org, geraadpleegd op 18 december 2020), een sterftecijfer van 15,9/1.000 levendgeborenen in Vietnam (statistieken 2019, data.worldbank.org, geraadpleegd op 18 december 2020), een totaal van 1.394.401 levendgeborenen in het hele land, en een landelijke bevolking van 97.752.966 waarvan 8.602.317 in HCMC wonen (2020-statistieken, worldometers.info, wereldbevolkingreview.org, geraadpleegd op 18 december 2020), schatten we dat er elk jaar 122.708 tot 144.046 kinderen in de stad worden geboren, waarvan er 120.756 tot 141.756 in leven zullen blijven. Op basis van een recent berekende algemene incidentie van 54/100.000 levendgeborenen in de staat Victoria, Australië, en een vergelijkbare voor leeftijd gecorrigeerde incidentie van 44,8/100.000 personen in Ba Vi, een landelijk district van Vietnam, schat dat er elk jaar 54-75 kinderen met SEI worden geboren in HCMC. Gezien het feit dat een meerderheid van deze kinderen op ND2 wordt gevolgd, en dat veel patiënten met ernstige neurologische aandoeningen afkomstig uit een breder gebied ook op ND2 consulteren, streven we ernaar om 50 kinderen per jaar in te schrijven.

Inclusiecriteria: Opeenvolgende patiënten die tijdens de onderzoeksperiode in het ND2-ziekenhuis zijn behandeld, zullen worden gevraagd om deel te nemen aan het onderzoek en zullen worden verzocht een toestemmingsformulier te ondertekenen als ze aan alle volgende inclusiecriteria voldoen:

1. Geneesmiddelresistente epilepsie, vanaf het begin of tijdens de follow-up (volgens ILAE 2010-criteria)
2. Ernstige ontwikkelingsachterstand of -regressie, volgens evaluatie door kinderneuroloog (of ontwikkelingsquotiënt <50, indien formeel beoordeeld)
3. Leeftijd waarop de belangrijkste symptomen beginnen (toevallen, ontwikkelingsachterstand): 0-36 maanden
4. Overeenkomst om deel te nemen aan de studie en ondertekend toestemmingsformulier Alle vooraf geselecteerde patiënten zullen worden besproken tijdens maandelijkse teleconferenties tussen het Nhi Dong 2-ziekenhuis en de universitaire ziekenhuizen van Genève voordat er bloedmonsters worden genomen. Er zullen bloedmonsters worden genomen van de patiënten en hun beide ouders, indien beschikbaar.

Uitsluitingscriteria: Patiënten met geïdentificeerde structurele, infectieuze of inflammatoire oorzaken (zoals perinatale hypoxische-ischemische encefalopathie, cerebrovasculaire aandoeningen, gevolgen van trauma of encefalitis, neurocutane aandoeningen, enz...) zullen niet worden gevraagd om deel te nemen aan het onderzoek.

Genetische onderzoeken:

Op basis van wat voorafgaat, zijn we van plan om ons genetisch onderzoek te starten met Whole Exome Sequencing (WES), en karyotypering en CGH-array te behouden voor gevallen waarin geen oorzakelijke variant wordt gevonden. WES is een meerstapsprocedure die DNA-extractie, exome-sequencing, verwerking en mapping, variantaanroepen, annotatie en prioritering omvat, zoals hieronder beschreven. In het geval van negatieve WES-resultaten, zal het nut van het uitvoeren van verdere tests worden geëvalueerd in de geplande Genome Board (GB)-sessies.

Genomische DNA-extractie en exome-sequencing In het kort, voor elke deelnemer en zijn/haar beide ouders wordt 2-5 ml volbloed afgenomen en opgeslagen in buisjes die zijn gecoat met K2/K3-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-anticoagulantia. Genomisch DNA zal worden geëxtraheerd met behulp van een DNA Mini Blood Isolation kit (QIAGEN DmbH, Nederland). De hoeveelheid DNA wordt gemeten met Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), een ultragevoelige fluorescerende nucleïnezuurkleuringsmethode voor het kwantificeren van dubbelstrengs DNA, met behulp van Victor 3-fluorometrie, en de toestand van DNA wordt beoordeeld met 1% gel elektroforese om de kwaliteit en kwantiteit van DNA-monsters te waarborgen vóór de sequentiestap.

Whole Exome Sequencing richt zich op alle eiwitcoderende regio's en is verantwoordelijk voor 85% van de zeer penetrante mutaties in het menselijk genoom. Whole Exome Sequencing zal worden uitgevoerd in een CLIA-gecertificeerd laboratorium bij Macrogen Ltd., Seoul, Korea. De geconstrueerde bibliotheken zullen worden gesequenced met behulp van de Agilent SureSelect V5 exome capture kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Californië, VS), die 120-meer gebiotinyleerde cRNA-aas gebruikt om exome-regio's (357.999 exons in totaal) te vangen en te verrijken, op een NovaSeq 6000 sequencing-systeem (Illumina, San Diego, CA, VS).

DNA-sequenties verkregen door WES (FASTQ-bestanden) zullen "in silico" parallel worden geanalyseerd, maar blind voor elkaar, in Ho Chi Minh City en in Genève, evenals beslissingen voor aanvullende, gerichte analyses op basis van de fenotypische beschrijving (bijv. Sanger-sequencing van enkele slecht bedekte exons in specifieke genen). Daartoe zullen gecodeerde aliquots van patiënten en ouderlijk DNA naar Genève worden overgebracht.

Ruwe gegevensverwerking en mapping Ruwe gegevens zullen worden geanalyseerd in Ho Chi Minh City met behulp van een interne bio-informatica-pijplijn, en onafhankelijk in Genève. De kwaliteit van de onbewerkte FASTQ-gegevens wordt gegarandeerd door Phred-scoretoewijzing, GC-inhoud, leeslengte, leeskwaliteit en sequentieduplicatieniveau. Er wordt een voorbewerkingsstap met behulp van Trimmomatic toegepast om leesbewerkingen van lage kwaliteit en verontreinigingssequenties van adapters weg te werken. De algoritmen van BWA-MEM, PICARD en GATK zullen worden gebruikt voor mapping en aanvullende verwerking na uitlijning, inclusief het verwijderen van duplicaten en herkalibratie van basiskwaliteit om artefacten te markeren of te verwijderen.

Variantoproep en annotatie De verfijnde kaartgegevens worden vervolgens verder verwerkt voor variantoproep en annotatie door GATK Haplotype Caller en ANNOVAR. Functionele voorspelling en annotatie van alle potentiële kandidaten zal vervolgens worden uitgevoerd door dbNSFP, inclusief 29 algoritmen, 9 instandhoudingsscores en gerelateerde informatie waargenomen in veel populatiedatabases zoals 1000 Genomes, ExAC, gnomAD en het NHLBI Exome-sequencingproject ESP6500 Variantprioritering De vermoedelijke etiologische varianten gefilterd door een gericht epilepsiepanel van 671 genen zullen grondig worden geanalyseerd volgens de aanbevelingen uit 2015 van het American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Sanger-sequencing zal ook worden gebruikt om de gezinsscheiding van alle gedetecteerde kandidaat-varianten te valideren, zoals aanbevolen. De varianten zijn ingedeeld in vijf categorieën: 1) goedaardig, 2) waarschijnlijk goedaardig, 3) onzekere significantie, 4) waarschijnlijk pathogeen en 5) pathogeen. De varianten met kleine allelfrequenties >0,05 in een van deze databases: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC en NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) worden uitgefilterd. De uitgevoerde analyses omvatten computationele analyse van DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Functional Analysis through Hidden Markov Models-MKL-codering, gecombineerde annotatie-afhankelijke uitputting en EIGEN-score.

De enorme sequentiegegevens, beperkte bekende ziektemechanismen en genetische heterogeniteit dragen bij aan de complexiteit van veel aandoeningen, zoals DEE's. Aldus zal sluitende variantinterpretatie worden uitgevoerd in multidisciplinaire discussies tussen genetici, clinici, laboratoriumtechnici en biostatistici tijdens reguliere formele genome board (GB) -sessies, gedurende de onderzoeksperiode.

GB's zijn multidisciplinaire sessies die worden georganiseerd door het HUG Centre of Genomic Medicine (CGEM), waar dossiers worden bekeken van patiënten die tot nu toe aan de diagnose zijn ontsnapt. GB's kinderneurologie brachten neuro-kinderartsen, kinderradiologen, klinisch genetici, biologen en bio-informatici van de afdeling Genetische Geneeskunde samen, evenals andere specialisten op verzoek van de casussen, b.v. volwassen neurologen, specialisten in laboratoriumgeneeskunde, immunologen of andere specialisten. Samen bekijken ze de genetische varianten van de patiënt in genen die de ziekte zouden kunnen verklaren, en verwerpen ze of stellen voor om aanvullende, uiterst gerichte onderzoeken te bestellen voor a posteriori validatie van het fenotype. Als er geen diagnose kan worden gesteld, wordt de patiënt uitgenodigd om 18-24 maanden later terug te komen naar de kliniek voor een nieuwe GB. Onze interne serie laat zien dat GB's sinds de implementatie in februari 2019 de HUG in staat hebben gesteld het diagnosepercentage van DEE te verhogen van ongeveer 45% naar 55%. GB's vinden plaats in een videoconferentieruimte die is uitgerust voor de veilige en vertrouwelijke uitwisseling van patiëntgegevens onder medisch geheim over lange afstanden. Genetische gegevens van de patiënten worden besproken, maar niet gekopieerd of overgedragen van het ene centrum naar het andere. De gegevens bestaan ​​uit een lijst van genetische varianten in verschillende genen van de beoogde WES, met annotaties van openbare en interne databases (bijv. GnomAD) samen met berekeningen van bioinformatica-tools (bijv. CADD-score). Doorgaans zal de neuro-kinderarts de klinische gegevens van de patiënt presenteren, zal de kinderradioloog de MRI tonen en becommentariëren, zal de geneticus de klinisch relevante genen presenteren die kandidaat-varianten dragen, en zal het laboratoriumteam voor moleculaire diagnostiek van biologen en bio-informatici kwalificeren. de varianten als pathogeen, waarschijnlijk pathogeen of van onbekende betekenis. In het laatste geval zal het team tijdens de GB de literatuur bekijken om te beslissen of een aanvullende test een vermoedelijke diagnose definitief kan bevestigen, d.w.z. het fenotype bevestigen dat wordt veroorzaakt door het gen dat een variant draagt ​​die tot nu toe is gekwalificeerd als van onbekende betekenis.

We hebben sinds 2012 expertise in sequentiëringsbenaderingen van de volgende generatie ter ondersteuning van klinische diagnostiek van genetische ziekten en leveren bio-informaticaplatforms en andere translationele SNP-screening op basis van genoombrede associatiestudies. Het team is sterk geïnteresseerd in het bijdragen aan de database van Vietnamese genomische zeldzame ziekten.