Genetiska undersökningar av barn med utvecklings- och epileptisk encefalopati i Ho Chi Minh City, Vietnam

Med denna prospektiva kohortstudie vill vi veta andelen barn med utvecklingsmässiga och epileptiska encefalopatier som följs vid den största pediatriska neurologiska anläggningen i Sydvietnam och inskrivna i följd för vilka avancerade genetiska undersökningar tillåter identifiering av patogena genvarianter. Vi räknar med att denna andel blir 50 %.

Vi kommer också att undersöka andelen barn hos vilka de genetiska resultaten kommer att möjliggöra individualiserade behandlingsanpassningar och globala förvaltningsförändringar. Vi räknar med att denna andel är minst 10 %.

Detta samarbetsprojekt är det första steget för att demonstrera den kliniska nyttan av genetiska procedurer med hög genomströmning för alla patienter med allvarlig tidig epilepsi och utvecklingssvårigheter i Vietnam. Parallella analyser av patienternas exomsekvenser i Vietnam och Schweiz kommer att möjliggöra optimering av proceduren.

Patientval:

Baserat på ett födelsetal på 16 745 barn/1 000 personer i Vietnam (2018 statistik, data.worldbank.org, konsulterad 18 december 2020), en dödlighet på 15,9/1 000 levande födda i Vietnam (2019 statistik, data.worldbank.org, konsulterad 18 december 2020), totalt 1 394 401 levande födda i hela landet och en rikstäckande befolkning på 97 752 966, varav 8 602 317 bor i HCMC (2020 statistik, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsulterad 18 december 2020), uppskattar vi att 122'708 till 144'046 barn föds i staden varje år, varav 120'756 till 141'756 kommer att överleva. På grundval av en nyligen beräknad allmän förekomst av 54/100 000 levande födda i delstaten Victoria, Australien, och en jämförbar åldersjusterad incidens på 44,8/100 000 personer i Ba Vi, ett landsbygdsdistrikt i Vietnam, har vi uppskattar att 54-75 barn med SEI föds varje år i HCMC. Med tanke på att en majoritet av dessa barn följs vid ND2, och att många patienter med svåra neurologiska tillstånd som kommer från ett bredare område också konsulterar på ND2, är vårt mål att registrera 50 barn per år.

Inklusionskriterier: På varandra följande patienter, som behandlas på ND2-sjukhuset under studieperioden, kommer att uppmanas att delta i studien och kommer att uppmanas att underteckna ett samtyckesformulär om de uppfyller alla följande inklusionskriterier:

1. Läkemedelsresistent epilepsi, antingen från början eller vid uppföljning (enligt ILAE 2010-kriterier)
2. Allvarlig utvecklingsförsening eller regression, enligt utvärdering av pediatrisk neurolog (eller utvecklingskvot <50, om den är formellt bedömd)
3. Ålder för debut av huvudsakliga symtom (kramper, utvecklingsförsening): 0-36 månader
4. Överenskommelse om att delta i studien och undertecknat samtyckesformulär Alla förutvalda patienter kommer att diskuteras i månatliga telefonkonferenser mellan Nhi Dong 2-sjukhuset och Genèves universitetssjukhus innan blodprover tas. Blodprover kommer att tas från patienterna och deras båda föräldrar, när sådana finns.

Uteslutningskriterier: Patienter med identifierade strukturella, infektiösa eller inflammatoriska orsaker (såsom perinatal hypoxisk-ischemisk encefalopati, cerebrovaskulära störningar, följder av trauma eller encefalit, neurokutana sjukdomar, etc...) kommer inte att uppmanas att delta i studien.

Genetiska undersökningar:

Baserat på vad som föregår, avser vi att starta våra genetiska undersökningar med Whole Exome Sequencing (WES), och behålla karyotypning och CGH-array för fall där ingen orsaksvariant hittas. WES är en flerstegsprocedur som inkluderar DNA-extraktion, exomsekvensering, bearbetning och kartläggning, variantanrop, annotering och prioritering, som beskrivs nedan. I händelse av negativa WES-resultat kommer nyttan av att utföra ytterligare tester att utvärderas i de planerade Genome Board-sessionerna (GB).

Genomisk DNA-extraktion och exomsekvensering I korthet, för varje deltagare och båda hans/hennes föräldrar, kommer 2-5 ml helblod att tas och förvaras i rör belagda med K2/K3-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) antikoagulantia. Genomiskt DNA kommer att extraheras med ett DNA Mini Blood Isolation-kit (QIAGEN DmbH, Nederländerna). DNA-mängden kommer att mätas med Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), en ultrakänslig fluorescerande nukleinsyrafärgningsmetod för kvantifiering av dubbelsträngat DNA, med Victor 3-fluorometri, och tillståndet hos DNA kommer att bedömas med 1 % gel elektrofores för att säkerställa kvaliteten och kvantiteten av DNA-prover före sekvenseringssteget.

Whole Exome Sequencing riktar sig till alla proteinkodande regioner och står för 85 % av mycket penetrerande mutationer i det mänskliga genomet. Hel Exome-sekvensering kommer att utföras i ett CLIA-certifierat laboratorium vid Macrogen Ltd., Seoul, Korea. De konstruerade biblioteken kommer att sekvenseras med hjälp av Agilent SureSelect V5 exome capture kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA), som använder 120-mer biotinylerat cRNA-beten för att fånga och berika exomregioner (357 999 exoner totalt), på en NovaSeq 6000 sekvenseringssystem (Illumina, San Diego, CA, USA).

DNA-sekvenser som erhålls av WES (FASTQ-filer) kommer att analyseras "i silico" parallellt, men förblindade för varandra, i Ho Chi Minh City och i Genève, liksom beslut om ytterligare, fokuserade analyser baserade på den fenotypiska beskrivningen (t.ex. Sanger-sekvensering av några dåligt täckta exoner i specifika gener). För detta ändamål kommer kodade alikvoter av patienter och föräldrarnas DNA att överföras till Genève.

Rådatabearbetning och kartläggning Rådata kommer att analyseras i Ho Chi Minh City med hjälp av en intern bioinformatikpipeline, och oberoende i Genève. Kvaliteten på FASTQ-rådata kommer att säkerställas av Phred-poängtilldelning, GC-innehåll, läslängd, läskvalitet och sekvensdupliceringsnivå. Förbearbetningssteget med Trimmomatic kommer att tillämpas för att trimma ut eventuella avläsningar av låg kvalitet och adapterföroreningssekvenser. Algoritmerna från BWA-MEM, PICARD och GATK kommer att användas för kartläggning och ytterligare efterjusteringsbearbetning, inklusive att ta bort dubbletter och omkalibrering av baskvalitet för att markera eller ta bort eventuella artefakter.

Variantanrop och annotering Den förfinade mappningsdatan kommer sedan att bearbetas ytterligare för variantanrop och annotering av GATK Haplotype Caller och ANNOVAR. Funktionell förutsägelse och anteckning av alla potentiella kandidater kommer sedan att utföras av dbNSFP inklusive 29 algoritmer, 9 bevarandepoäng och relaterad information observerad i många populationsdatabaser som 1000 Genomes, ExAC, gnomAD och NHLBI Exome-sekvenseringsprojektet ESP6500 Variantprioritering. misstänkta etiologiska varianter som filtrerats av en riktad epilepsipanel med 671 gener kommer att analyseras grundligt enligt 2015 års rekommendationer från American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Sanger-sekvensering kommer också att användas för att validera familjesegregeringen av alla upptäckta kandidatvarianter, enligt rekommendation. Varianterna klassificeras i fem kategorier: 1) benigna, 2) sannolikt benigna, 3) osäker signifikans, 4) sannolikt patogena och 5) patogena. Varianterna med mindre allelfrekvenser >0,05 i någon av dessa databaser: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC och NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) kommer att filtreras bort. Analyserna som utförs kommer att inkludera beräkningsanalys av DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Funktionsanalys genom Hidden Markov Models-MKL-kodning, Kombinerad annoteringsberoende utarmning och EIGEN-poäng.

De massiva sekvensdata, begränsade kända sjukdomsmekanismer och genetisk heterogenitet bidrar till komplexiteten hos många tillstånd, såsom DEEs. Således kommer avgörande varianttolkning att genomföras i tvärvetenskapliga diskussioner mellan genetiker, kliniker, laboratorietekniker och biostatistiker under regelbundna formella genome board-sessioner (GB) under hela studieperioden.

GBs är multidisciplinära sessioner som anordnas av HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), där filer med patienter granskas, som hittills undvikit diagnos. Barnneurologi GB:er sammanställer neuropediatriker, barnröntgenläkare, kliniska genetiker, biologer och bioinformatiker från avdelningen Genetisk medicin samt andra specialister som efterfrågas av ärendena, t.ex. vuxna neurologer, laboratoriemedicinska specialister, immunologer eller andra specialister. Tillsammans granskar de patientens genetiska varianter i gener som kan förklara sjukdomen, och antingen förkastar de dem eller föreslår att ytterligare, extremt fokuserade undersökningar ska beställas för a posteriori validering av fenotypen. Om ingen diagnos kan uppnås, uppmanas patienten att komma tillbaka till kliniken för en ny GB 18-24 månader senare. Vår interna serie visar att, sedan de implementerades i februari 2019, har GBs tillåtit HUG att öka sin diagnostikfrekvens av DEE från cirka 45 % till 55 %. GBs äger rum i ett videokonferensrum utrustat för säkert och konfidentiellt utbyte av patientdata under medicinsk sekretess över långa avstånd. Genetiska data om patienterna diskuteras men inte kopieras eller överförs från ett center till ett annat. Data består av en lista över genetiska varianter i olika gener av det riktade WES, med kommentarer från offentliga och interna databaser (t.ex. GnomAD) tillsammans med beräkningar från bioinformatikverktyg (t.ex. CADD-poäng). Vanligtvis kommer neurobarnläkaren att presentera patientens kliniska data, den pediatriska radiologen kommer att visa och kommentera MRI, genetikern kommer att presentera de kliniskt relevanta generna som bär kandidatvarianter, och laboratorieteamet för molekylärdiagnostik av biologer och bioinformatiker kommer att kvalificera sig varianterna som patogena, sannolikt patogena eller av okänd betydelse. I det senare fallet kommer teamet att granska litteraturen, under GB, för att avgöra om ett ytterligare test definitivt kan bekräfta en förmodad diagnos, det vill säga bekräfta fenotypen som orsakas av genen som bär på en variant som hittills har kvalificerats som av okänd betydelse.

Vi har expertis inom nästa generations sekvenseringsmetoder för att stödja klinisk diagnostik av genetiska sjukdomar sedan 2012 och tillhandahåller bioinformatikplattformar och annan translationell SNP-screening baserad på genomomfattande associationsstudier. Teamet är starkt intresserade av att bidra med vietnamesisk databas för genomiska sällsynta sjukdomar.