Genetická vyšetření u dětí s vývojovými a epileptickými encefalopatiemi v Ho Či Minově Městě, Vietnam

Touto prospektivní kohortovou studií chceme znát podíl dětí s vývojovými a epileptickými encefalopatiemi sledovaných na největším dětském neurologickém pracovišti v Jižním Vietnamu a následně zařazených, kterým pokročilá genetická vyšetření umožňují identifikaci patogenních genových variant. Očekáváme, že tento podíl bude 50 %.

Budeme také zkoumat podíl dětí, u kterých genetické výsledky umožní individualizované adaptace léčby a změny globálního managementu. Očekáváme, že tento podíl bude alespoň 10 %.

Tento společný projekt je prvním krokem k prokázání klinické užitečnosti vysoce výkonných genetických postupů pro všechny pacienty s těžkou ranou epilepsií a vývojovými obtížemi ve Vietnamu. Paralelní analýzy sekvencí exomů pacientů ve Vietnamu a Švýcarsku umožní optimalizaci postupu.

Výběr pacienta:

Na základě porodnosti 16 745 dětí/1 000 lidí ve Vietnamu (statistika za rok 2018, data.worldbank.org, konzultováno 18. prosince 2020), úmrtnost 15,9/1 000 živě narozených dětí ve Vietnamu (statistika 2019, data.worldbank.org, konzultováno 18. prosince 2020), celkem 1'394'401 živě narozených dětí v celé zemi a celostátní populace 97'752'966, z toho 8'602'317 žije v HCMC (statistiky 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konzultováno 18. prosince 2020) odhadujeme, že se ve městě každý rok narodí 122'708 až 144'046 dětí, z nichž 120'756 až 141'756 zůstane naživu. Na základě nedávno vypočítané obecné incidence 54/100 000 živě narozených dětí ve státě Victoria v Austrálii a srovnatelné incidence přizpůsobené věku 44,8/100 000 osob v Ba Vi, venkovské oblasti Vietnamu, jsme odhadují, že v HCMC se ročně narodí 54–75 dětí se SEI. Vzhledem k tomu, že většina těchto dětí je sledována v ND2 a že do ND2 konzultuje i mnoho pacientů s těžkým neurologickým onemocněním pocházejících z širší oblasti, je naším cílem zapsat 50 dětí ročně.

Kritéria pro zařazení: Po sobě jdoucí pacienti léčení v nemocnici ND2 během období studie budou požádáni o účast ve studii a budou požádáni, aby podepsali formulář souhlasu, pokud splňují všechna následující kritéria pro zařazení:

1. Léčivě rezistentní epilepsie, buď od počátku nebo při následném sledování (podle kritérií ILAE 2010)
2. Závažné vývojové zpoždění nebo regrese podle hodnocení dětského neurologa (nebo vývojový kvocient <50, pokud je formálně hodnocen)
3. Věk nástupu hlavních příznaků (záchvaty, opožděný vývoj): 0-36 měsíců
4. Souhlas s účastí ve studii a podepsaný formulář souhlasu Všichni předem vybraní pacienti budou před odebráním vzorků krve prodiskutováni na měsíčních telekonferencích mezi nemocnicí Nhi Dong 2 a ženevskými univerzitními nemocnicemi. Vzorky krve budou odebrány pacientům a jejich oběma rodičům, pokud budou k dispozici.

Kritéria vyloučení: Pacienti s identifikovanými strukturálními, infekčními nebo zánětlivými příčinami (jako je perinatální hypoxicko-ischemická encefalopatie, cerebrovaskulární poruchy, následky traumatu nebo encefalitidy, neurokutánní poruchy atd...) nebudou požádáni o účast ve studii.

Genetické vyšetření:

Na základě toho, co předchází, máme v úmyslu zahájit naše genetické vyšetřování pomocí Whole Exome Sequencing (WES) a ponechat karyotypizaci a CGH-array pro případy, ve kterých nebyla nalezena žádná kauzální varianta. WES je vícekrokový postup, který zahrnuje extrakci DNA, sekvenování exomu, zpracování a mapování, volání variant, anotaci a stanovení priorit, jak je popsáno níže. V případě negativních výsledků WES bude užitečnost provedení dalších testů vyhodnocena na plánovaných zasedáních Genome Board (GB).

Extrakce genomové DNA a sekvenování exomů Stručně řečeno, každému účastníkovi a oběma jeho rodičům bude odebráno 2–5 ml plné krve a uloženo ve zkumavkách potažených antikoagulanty kyseliny K2/K3-ethylendiamintetraoctové (EDTA). Genomická DNA bude extrahována pomocí DNA Mini Blood Isolation kit (QIAGEN DmbH, Nizozemsko). Množství DNA bude měřeno pomocí Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), ultracitlivou metodou fluorescenčního barvení nukleových kyselin pro kvantifikaci dvouvláknové DNA pomocí fluorometrie Victor 3, a stav DNA bude hodnocen pomocí 1% gelu elektroforéza k zajištění kvality a množství vzorků DNA před krokem sekvenování.

Whole Exome Sequencing se zaměřuje na všechny oblasti kódující protein a odpovídá za 85 % vysoce penetrantních mutací v lidském genomu. Celé sekvenování Exome bude provedeno v laboratoři certifikované CLIA v Macrogen Ltd., Soul, Korea. Vytvořené knihovny budou sekvenovány pomocí soupravy pro zachycení exomu Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornie, USA), která využívá 120merní biotinylované cRNA návnady k zachycení a obohacení oblastí exomu (celkem 357 999 exonů) na NovaSeq. 6000 sekvenční systém (Illumina, San Diego, CA, USA).

Sekvence DNA získané pomocí WES (soubory FASTQ) budou analyzovány "in silico" paralelně, ale vzájemně slepé, v Ho Či Minově Městě a v Ženevě, stejně jako rozhodnutí o dalších cílených analýzách založených na fenotypovém popisu (např. Sangerovo sekvenování některých nedostatečně pokrytých exonů ve specifických genech). Za tímto účelem budou kódované alikvoty pacientů a rodičovské DNA přeneseny do Ženevy.

Zpracování a mapování nezpracovaných dat Nezpracovaná data budou analyzována v Ho Či Minově Městě pomocí vlastního bioinformatického potrubí a nezávisle v Ženevě. Kvalita nezpracovaných dat FASTQ bude zajištěna přiřazením skóre Phred, obsahem GC, délkou čtení, kvalitou čtení a úrovní duplikace sekvence. Krok předběžného zpracování pomocí Trimmomatic bude použit k odstranění všech nekvalitních čtení a sekvencí kontaminujících adaptérů. Algoritmy od BWA-MEM, PICARD a GATK budou použity pro mapování a další zpracování po zarovnání, včetně odstraňování duplikátů a rekalibrace základní kvality pro označení nebo odstranění jakýchkoli artefaktů.

Volání a anotace variant Upřesněná mapovací data budou následně dále zpracována pro volání variant a anotaci pomocí GATK Haplotype Caller a ANNOVAR. Funkční predikce a anotace všech potenciálních kandidátů pak provede dbNSFP včetně 29 algoritmů, 9 konzervačních skóre a souvisejících informací pozorovaných v mnoha populačních databázích, jako je 1000 Genomes, ExAC, gnomAD a sekvenační projekt NHLBI Exome ESP6500 Prioritizace variant The suspektní etiologické varianty filtrované cíleným epileptickým panelem 671 genů budou důkladně analyzovány podle doporučení z roku 2015 Americké vysoké školy lékařské genetiky a genomiky (ACMG). Sangerovo sekvenování bude také použito k ověření rodinné segregace všech detekovaných kandidátních variant, jak je doporučeno. Varianty jsou klasifikovány do pěti kategorií: 1) benigní, 2) pravděpodobně benigní, 3) nejistá významnost, 4) pravděpodobně patogenní a 5) patogenní. Budou odfiltrovány varianty s menší frekvencí alel >0,05 v kterékoli z těchto databází: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC a NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500). Provedené analýzy budou zahrnovat výpočetní analýzu DANN, profilování genomové evoluční rychlosti++, test poměru pravděpodobnosti, test mutací, funkční analýzu prostřednictvím skrytých Markovových modelů-kódování MKL, kombinované vyčerpání závislé na anotaci a skóre EIGEN.

Masivní sekvenční data, omezené známé mechanismy onemocnění a genetická heterogenita přispívají ke složitosti mnoha stavů, jako jsou DEE. Definitivní variantní interpretace tedy bude prováděna v multidisciplinárních diskusích mezi genetiky, kliniky, laboratorními techniky a biostatistiky během pravidelných formálních zasedání genomové rady (GB) po celou dobu studie.

GB jsou multidisciplinární sezení pořádané Centrem genomické medicíny HUG (CGEM), kde se prověřují soubory pacientů, kteří dosud diagnóze unikali. Dětská neurologie GB sdružuje neuropediatry, dětské radiology, klinické genetiky, biology a bioinformatiky z divize Genetické medicíny, ale i další specialisty dle požadavků případů, např. dospělí neurologové, specialisté na laboratorní medicínu, imunologové nebo jiní specialisté. Společně přezkoumávají pacientovy genetické varianty v genech, které by mohly vysvětlit onemocnění, a buď je odmítnou, nebo navrhnou nařídit další, extrémně zaměřená vyšetření pro aposteriorní ověření fenotypu. Pokud nelze dosáhnout žádné diagnózy, je pacient vyzván, aby se vrátil na kliniku pro novou GB o 18–24 měsíců později. Naše interní série ukazuje, že od implementace v únoru 2019 umožnily GB HUG zvýšit míru diagnostiky DEE z přibližně 45 % na 55 %. GB se konají ve videokonferenční místnosti vybavené pro bezpečnou a důvěrnou výměnu dat pacientů pod lékařským tajemstvím na velké vzdálenosti. Genetická data pacientů jsou diskutována, ale nejsou kopírována ani přenášena z jednoho centra do druhého. Data se skládají ze seznamu genetických variant v různých genech cíleného WES, s poznámkami z veřejných a interních databází (např. GnomAD) spolu s výpočty z bioinformatických nástrojů (např. skóre CADD). Neuropediatr obvykle předloží klinická data pacienta, dětský radiolog ukáže a okomentuje MRI, genetik představí klinicky relevantní geny, které nesou kandidátské varianty, a tým laboratoří molekulární diagnostiky složený z biologů a bioinformatiků se kvalifikuje. varianty jako patogenní, pravděpodobně patogenní nebo s neznámým významem. V druhém případě tým během GB zkontroluje literaturu, aby rozhodl, zda by další test mohl definitivně potvrdit domnělou diagnózu, tj. potvrdit fenotyp způsobený genem nesoucím variantu, která je dosud kvalifikována jako neznámý význam.

Od roku 2012 máme odborné znalosti v přístupech sekvenování nové generace na podporu klinické diagnostiky genetických onemocnění a dodáváme bioinformatické platformy a další translační screening SNP na základě celogenomových asociačních studií. Tým má velký zájem o přispění vietnamské databáze genomických vzácných onemocnění.