Enquêtes génétiques chez les enfants atteints d'encéphalopathies développementales et épileptiques à Ho Chi Minh-Ville, Vietnam

Avec cette étude de cohorte prospective, nous souhaitons connaître la proportion d'enfants atteints d'encéphalopathies développementales et épileptiques suivis dans le plus grand centre de neurologie pédiatrique du Sud-Vietnam et inscrits consécutivement pour lesquels des investigations génétiques avancées permettent l'identification de variants de gènes pathogènes. Nous prévoyons que cette proportion sera de 50 %.

Nous étudierons également la proportion d'enfants chez qui les résultats génétiques permettront des adaptations thérapeutiques individualisées et des changements de prise en charge globale. Nous prévoyons que cette proportion sera d'au moins 10 %.

Ce projet collaboratif est la première étape pour démontrer l'utilité clinique des procédures génétiques à haut débit pour tous les patients atteints d'épilepsie sévère précoce et de troubles du développement au Viet Nam. Des analyses parallèles des séquences d'exomes de patients au Vietnam et en Suisse permettront d'optimiser la procédure.

Sélection des patients :

Basé sur un taux de natalité de 16.745 enfants/1000 personnes au Vietnam (statistiques 2018, data.worldbank.org, consulté le 18 décembre 2020), un taux de mortalité de 15,9/1'000 naissances vivantes au Vietnam (statistiques 2019, data.worldbank.org, consulté le 18 décembre 2020), un total de 1'394'401 naissances vivantes dans tout le pays, et une population nationale de 97'752'966 dont 8'602'317 vivent à HCMV (statistiques 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, consulté le 18 décembre 2020), on estime que 122'708 à 144'046 enfants naissent dans la ville chaque année, dont 120'756 à 141'756 resteront en vie. Sur la base d'une incidence générale récemment calculée de 54/100'000 naissances vivantes dans l'Etat de Victoria, Australie, et d'une incidence comparable ajustée sur l'âge de 44,8/100'000 personnes à Ba Vi, un district rural du Vietnam, nous estiment que 54 à 75 enfants atteints de SEI naissent chaque année à HCMV. Etant donné qu'une majorité de ces enfants sont suivis à ND2, et que de nombreux patients atteints de pathologies neurologiques sévères venant d'un territoire plus large consultent également à ND2, notre objectif est d'inscrire 50 enfants par an.

Critères d'inclusion : les patients consécutifs, traités à l'hôpital ND2 pendant la période d'étude, seront invités à participer à l'étude et devront signer un formulaire de consentement s'ils remplissent tous les critères d'inclusion suivants :

1. Épilepsie pharmacorésistante, dès le début ou au suivi (selon les critères ILAE 2010)
2. Retard de développement sévère ou régression, selon l'évaluation du neurologue pédiatrique (ou quotient de développement <50, si évalué formellement)
3. Âge d'apparition des principaux symptômes (Convulsions, Retard de développement) : 0-36 mois
4. Accord de participation à l'étude et formulaire de consentement signé Tous les patients présélectionnés seront discutés lors de téléconférences mensuelles entre l'hôpital Nhi Dong 2 et les Hôpitaux universitaires de Genève avant le prélèvement de sang. Des échantillons de sang seront prélevés sur les patients et leurs deux parents, lorsqu'ils seront disponibles.

Critères d'exclusion : les patients présentant des causes structurelles, infectieuses ou inflammatoires identifiées (telles qu'une encéphalopathie hypoxique-ischémique périnatale, des troubles cérébrovasculaires, des séquelles de traumatisme ou d'encéphalite, des troubles neurocutanés, etc.) ne seront pas invités à participer à l'étude.

Recherches génétiques :

Sur la base de ce qui précède, nous avons l'intention de commencer nos investigations génétiques par séquençage de l'exome entier (WES), et de conserver le caryotypage et le CGH-array pour les cas dans lesquels aucune variante causale n'est trouvée. WES est une procédure en plusieurs étapes qui comprend l'extraction d'ADN, le séquençage de l'exome, le traitement et la cartographie, l'appel de variantes, l'annotation et la hiérarchisation, comme décrit ci-dessous. En cas de résultats WES négatifs, l'utilité d'effectuer d'autres tests sera évaluée lors des sessions prévues du Genome Board (GB).

Extraction d'ADN génomique et séquençage de l'exome En bref, pour chaque participant et ses deux parents, 2 à 5 ml de sang total seront prélevés et stockés dans des tubes recouverts d'anticoagulants K2/K3-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). L'ADN génomique sera extrait à l'aide d'un kit DNA Mini Blood Isolation (QIAGEN DmbH, Pays-Bas). La quantité d'ADN sera mesurée par le kit d'analyse Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA (Invitrogen), une méthode de coloration d'acide nucléique fluorescent ultra-sensible pour quantifier l'ADN double brin, en utilisant la fluorométrie Victor 3, et l'état de l'ADN sera évalué par 1% gel électrophorèse pour s'assurer de la qualité et de la quantité des échantillons d'ADN avant l'étape de séquençage.

Le séquençage de l'exome entier cible toutes les régions codant pour les protéines et représente 85 % des mutations hautement pénétrantes du génome humain. Le séquençage de l'exome entier sera effectué dans un laboratoire certifié CLIA de Macrogen Ltd., Séoul, Corée. Les bibliothèques construites seront séquencées à l'aide du kit de capture d'exome Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis), qui utilise des appâts d'ARNc biotinylés 120-mer pour capturer et enrichir les régions d'exome (357 999 exons au total), sur un NovaSeq Système de séquençage 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA).

Les séquences d'ADN obtenues par WES (fichiers FASTQ) seront analysées "in silico" en parallèle, mais en aveugle les unes des autres, à Ho Chi Minh Ville et à Genève, tout comme les décisions pour des analyses supplémentaires ciblées basées sur la description phénotypique (par exemple, Séquençage Sanger de certains exons mal couverts dans des gènes spécifiques). À cette fin, des aliquotes codées de patients et d'ADN parentaux seront transférées à Genève.

Traitement et cartographie des données brutes Les données brutes seront analysées à Ho Chi Minh-Ville à l'aide d'un pipeline bioinformatique interne, et indépendamment à Genève. La qualité des données brutes FASTQ sera assurée par l'attribution de Phred-score, le contenu GC, la longueur de lecture, la qualité de lecture et le niveau de duplication de séquence. L'étape de prétraitement à l'aide de Trimmomatic sera appliquée pour éliminer toutes les lectures de mauvaise qualité et les séquences de contaminants de l'adaptateur. Les algorithmes de BWA-MEM, PICARD et GATK seront utilisés pour la cartographie et le traitement post-alignement supplémentaire, y compris la suppression des doublons et le recalibrage de la qualité de base pour marquer ou supprimer tout artefact.

Appel et annotation de variantes Les données de cartographie raffinées seront ensuite traitées pour l'appel et l'annotation de variantes par GATK Haplotype Caller et ANNOVAR. La prédiction fonctionnelle et l'annotation de tous les candidats potentiels seront ensuite effectuées par dbNSFP, y compris 29 algorithmes, 9 scores de conservation et des informations connexes observées dans de nombreuses bases de données de population telles que 1000 Genomes, ExAC, gnomAD et le projet de séquençage NHLBI Exome ESP6500 Priorisation des variantes Le les variantes étiologiques suspectées filtrées par un panel d'épilepsie ciblé de 671 gènes seront analysées en profondeur selon les recommandations 2015 de l'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Le séquençage Sanger sera également utilisé pour valider la ségrégation familiale de toutes les variantes candidates détectées, comme recommandé. Les variantes sont classées en cinq catégories : 1) bénignes, 2) probablement bénignes, 3) signification incertaine, 4) probablement pathogènes et 5) pathogènes. Les variants avec des fréquences d'allèles mineurs > 0,05 dans l'une de ces bases de données : dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC et NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) seront filtrés. Les analyses effectuées comprendront l'analyse informatique de DANN, le profilage du taux d'évolution génomique ++, le test du rapport de vraisemblance, le testeur de mutation, l'analyse fonctionnelle via le codage des modèles de Markov cachés-MKL, l'épuisement combiné dépendant des annotations et le score EIGEN.

Les données de séquence massives, les mécanismes de maladie connus limités et l'hétérogénéité génétique contribuent à la complexité de nombreuses conditions, telles que les DEE. Ainsi, une interprétation concluante des variantes sera effectuée dans des discussions multidisciplinaires entre généticiens, cliniciens, techniciens de laboratoire et biostatisticiens lors de sessions régulières formelles du conseil du génome (GB), tout au long de la période d'étude.

Les GB sont des séances pluridisciplinaires animées par le Centre de Médecine Génomique des HUG (CGEM), où sont examinés les dossiers des patients jusqu'ici échappés au diagnostic. Les GB de neurologie pédiatrique regroupent des neuropédiatres, des radiologues pédiatriques, des généticiens cliniques, des biologistes et des bioinformaticiens du service de médecine génétique, ainsi que d'autres spécialistes à la demande des cas, par ex. neurologues adultes, spécialistes en médecine de laboratoire, immunologistes ou autres spécialistes. Ensemble, ils passent en revue les variantes génétiques du patient dans les gènes qui pourraient expliquer la maladie, et soit les rejettent, soit proposent de commander des investigations supplémentaires extrêmement ciblées pour une validation a posteriori du phénotype. Si aucun diagnostic ne peut être établi, le patient est invité à revenir à la clinique pour un nouveau GB 18 à 24 mois plus tard. Notre série interne montre que, depuis leur mise en place en février 2019, les GB ont permis aux HUG de faire passer son taux de diagnostic de DEE d'environ 45% à 55%. Les GB se déroulent dans une salle de visioconférence équipée pour l'échange sécurisé et confidentiel des données des patients sous secret médical sur de longues distances. Les données génétiques des patients sont discutées mais pas copiées ni transférées d'un centre à l'autre. Les données consistent en une liste de variantes génétiques dans différents gènes du WES ciblé, avec des annotations provenant de bases de données publiques et internes (par exemple, GnomAD) ainsi que des calculs à partir d'outils bioinformatiques (par exemple, le score CADD). Typiquement, le neuropédiatre présentera les données cliniques du patient, le radiologue pédiatrique montrera et commentera l'IRM, le généticien présentera les gènes cliniquement pertinents porteurs de variants candidats, et l'équipe du laboratoire de diagnostic moléculaire composée de biologistes et de bioinformaticiens qualifiera les variants comme pathogènes, probablement pathogènes ou de signification inconnue. Dans ce dernier cas, l'équipe passera en revue la littérature, lors du GB, pour décider si un test supplémentaire pourrait définitivement confirmer un diagnostic putatif, c'est-à-dire confirmer le phénotype causé par le gène porteur d'un variant jusqu'ici qualifié de signification inconnue.

Nous possédons une expertise dans les approches de séquençage de nouvelle génération pour soutenir le diagnostic clinique des maladies génétiques depuis 2012 et fournissons des plateformes bioinformatiques et d'autres dépistages translationnels de SNP basés sur des études d'association à l'échelle du génome. L'équipe est fortement intéressée à contribuer à la base de données vietnamienne sur les maladies rares génomiques.