Geneettiset tutkimukset lapsilla, joilla on kehitys- ja epileptinen enkefalopatia Ho Chi Minh Cityssä, Vietnamissa

Tällä prospektiivisella kohorttitutkimuksella haluamme tietää niiden lasten osuuden, joilla on kehityshäiriöitä ja epileptisiä enkefalopatioita, joita seurataan Etelä-Vietnamin suurimmassa lastenneurologian laitoksessa ja jotka on otettu peräkkäin ja joille edistyneet geneettiset tutkimukset mahdollistavat patogeenisten geenivarianttien tunnistamisen. Odotamme tämän osuuden olevan 50 prosenttia.

Selvitämme myös niiden lasten osuutta, joilla geneettiset tulokset mahdollistavat yksilölliset hoitosopeutukset ja globaalit johtamismuutokset. Odotamme tämän osuuden olevan vähintään 10 %.

Tämä yhteistyöprojekti on ensimmäinen askel korkean suorituskyvyn geneettisten toimenpiteiden kliinisen hyödyn osoittamisessa kaikille potilaille, joilla on vaikea varhain alkanut epilepsia ja kehitysvaikeudet Vietnamissa. Potilaiden eksomisekvenssien rinnakkaisanalyysit Vietnamissa ja Sveitsissä mahdollistavat toimenpiteen optimoinnin.

Potilasvalinta:

Perustuu syntyvyyteen 16 745 lasta/1000 ihmistä Vietnamissa (2018 tilastot, data.worldbank.org, konsultoitu 18.12.2020), kuolleisuusaste on 15,9/1 000 elävänä syntynyttä Vietnamissa (2019 tilastot, data.worldbank.org, konsultoitu 18.12.2020), yhteensä 1 394 401 elävänä syntynyttä koko maassa ja valtakunnallinen väkiluku 97 752 966, joista 8 602 317 asuu HCMC:ssä (2020 tilastot, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsultoitu 18.12.2020), arvioimme, että kaupungissa syntyy vuosittain 122 708 - 144 046 lasta, joista 120 756 - 141 756 jää eloon. Hiljattain lasketun 54/100 000 elävänä syntymän yleisen ilmaantuvuuden perusteella Victorian osavaltiossa Australiassa ja vastaavan ikäkorjatun ilmaantuvuuden 44,8/100 000 henkilön Ba Vi:n maaseutualueella Vietnamissa, arvioi, että HCMC:ssä syntyy vuosittain 54–75 SEI-sairaista lasta. Ottaen huomioon, että suurinta osaa näistä lapsista seurataan ND2:lla ja monet potilaat, joilla on vakavia neurologisia sairauksia laajemmalta alueelta, käyvät myös ND2:ssa, tavoitteenamme on ottaa mukaan 50 lasta vuodessa.

Osallistumiskriteerit: Peräkkäisiä potilaita, joita hoidetaan ND2-sairaalassa tutkimusjakson aikana, pyydetään osallistumaan tutkimukseen ja heitä pyydetään allekirjoittamaan suostumuslomake, jos he täyttävät kaikki seuraavat mukaanottokriteerit:

1. Lääkeresistentti epilepsia, joko alusta tai seurannan aikana (ILAE 2010 -kriteerien mukaan)
2. Vaikea kehityksen viivästyminen tai regressio lastenneurologin arvion mukaan (tai kehitysosamäärä <50, jos se on virallisesti arvioitu)
3. Pääoireiden alkamisikä (kohtaukset, kehitysviive): 0-36 kuukautta
4. Sopimus tutkimukseen osallistumisesta ja allekirjoitettu suostumuslomake Kaikista ennalta valituista potilaista keskustellaan kuukausittaisissa puhelinkokouksissa Nhi Dong 2 -sairaalan ja Geneven yliopistollisen sairaalan välillä ennen verinäytteiden ottamista. Potilailta ja heidän molemmilta vanhemmiltaan otetaan verinäytteitä, jos niitä on saatavilla.

Poissulkemiskriteerit: Tutkimukseen ei pyydetä osallistumaan potilaita, joilla on tunnistettu rakenteellisia, tarttuvia tai tulehduksellisia syitä (kuten perinataalinen hypoksi-iskeeminen enkefalopatia, aivoverenkiertohäiriöt, trauman tai enkefaliitin seuraukset, hermoston ihosairaudet jne.).

Geneettiset tutkimukset:

Edellisen perusteella aiomme aloittaa geneettiset tutkimuksemme Whole Exome Sequencingilla (WES) ja säilyttää karyotyypityksen ja CGH-taulukon tapauksissa, joissa syy-varianttia ei löydy. WES on monivaiheinen menettely, joka sisältää DNA:n erottamisen, eksomin sekvensoinnin, prosessoinnin ja kartoituksen, muunnelman kutsumisen, annotoinnin ja priorisoinnin, kuten alla on kuvattu. Jos WES-tulos on negatiivinen, lisätestien suorittamisen hyödyllisyys arvioidaan suunnitelluissa Genome Board (GB) istunnoissa.

Genomisen DNA:n erottaminen ja eksomin sekvensointi Lyhyesti sanottuna jokaisesta osallistujasta ja hänen molemmista vanhemmistaan ​​otetaan 2-5 ml kokoverinäyte ja varastoidaan putkiin, jotka on päällystetty K2/K3-etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA) antikoagulanteilla. Genominen DNA uutetaan käyttämällä DNA Mini Blood Isolation -pakkausta (QIAGEN DmbH, Alankomaat). DNA:n määrä mitataan Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen) -menetelmällä, joka on ultraherkkä fluoresoiva nukleiinihappovärjäysmenetelmä kaksijuosteisen DNA:n kvantifiointiin käyttäen Victor 3 -fluorometriaa, ja DNA:n kunto arvioidaan 1 % geelillä. elektroforeesi DNA-näytteiden laadun ja määrän varmistamiseksi ennen sekvensointivaihetta.

Whole Exome Sequencing kohdistuu kaikkiin proteiineja koodaaviin alueisiin ja se muodostaa 85 % erittäin tunkeutuvista mutaatioista ihmisen genomissa. Koko Exome-sekvensointi suoritetaan CLIA-sertifioidussa laboratoriossa Macrogen Ltd:ssä, Soulissa, Koreassa. Rakennetut kirjastot sekvensoidaan käyttämällä Agilent SureSelect V5 -eksomin sieppaussarjaa (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA), joka käyttää 120-meerisiä biotinyloituja cRNA-syöttejä eksomialueiden vangitsemiseen ja rikastamiseen (yhteensä 357 999 eksonia) NovaSeqillä. 6000 sekvensointijärjestelmä (Illumina, San Diego, CA, USA).

WES:n saamia DNA-sekvenssejä (FASTQ-tiedostot) analysoidaan "in silico" rinnakkain, mutta toisilleen sokaisina, Ho Chi Minh Cityssä ja Genevessä, samoin kuin päätökset lisätutkimuksista, jotka perustuvat fenotyyppikuvaukseen (esim. Joidenkin huonosti peitettyjen eksonien Sanger-sekvensointi tietyissä geeneissä). Tätä varten koodatut erät potilaista ja vanhempien DNA:ista siirretään Geneveen.

Raakadatan käsittely ja kartoitus Raakadataa analysoidaan Ho Chi Minh Cityssä käyttämällä omaa bioinformatiikkaa ja itsenäisesti Genevessä. FASTQ-raakadatan laatu varmistetaan Phred-pisteiden määrittämisellä, GC-sisällöllä, lukupituudella, lukulaadulla ja sekvenssin monistustasolla. Esikäsittelyvaihe Trimmomaticia käyttämällä leikataan pois huonolaatuisista lukemista ja sovittimen kontaminanttijaksoista. BWA-MEM-, PICARD- ja GATK-algoritmeja käytetään kartoitukseen ja lisäkäsittelyyn kohdistuksen jälkeen, mukaan lukien kaksoiskappaleiden poistaminen ja peruslaadun uudelleenkalibrointi artefaktien merkitsemiseksi tai poistamiseksi.

Vaihtoehtokutsu ja huomautus GATK Haplotype Caller ja ANNOVAR käsittelevät sitten tarkennetut kartoitustiedot muunnelmien kutsumista ja huomautuksia varten. Sen jälkeen dbNSFP suorittaa kaikkien mahdollisten ehdokkaiden toiminnallisen ennustamisen ja annotoinnin, mukaan lukien 29 algoritmia, 9 säilymispistettä ja niihin liittyvää tietoa, joka havaitaan monissa populaatiotietokannoista, kuten 1000 Genomes, ExAC, gnomAD ja NHLBI Exome -sekvensointiprojekti ESP6500 Variant Priorisation. Epäillyt etiologiset variantit, jotka on suodatettu kohdistetulla 671 geenin epilepsiapaneelilla, analysoidaan perusteellisesti American College of Medical Genetics and Genomicsin (ACMG) vuoden 2015 suositusten mukaisesti. Sanger-sekvensointia käytetään myös kaikkien havaittujen ehdokasvarianttien perheen erottelun vahvistamiseen, kuten suositellaan. Variantit luokitellaan viiteen luokkaan: 1) hyvänlaatuinen, 2) todennäköisesti hyvänlaatuinen, 3) epävarma merkitys, 4) todennäköisesti patogeeninen ja 5) patogeeninen. Muunnelmat, joiden alleelitiheydet ovat pienet > 0,05 missä tahansa näistä tietokannoista: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC ja NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) suodatetaan pois. Suoritetut analyysit sisältävät DANNin laskennallisen analyysin, Genomic Evolutionary Rate Profiling++:n, todennäköisyyssuhdetestin, mutaatiomaistelijan, toiminnallisen analyysin piilotettujen Markov-mallien MKL-koodauksen avulla, yhdistetyn huomautuksista riippuvan tyhjentymisen ja EIGEN-pisteet.

Massiiviset sekvenssitiedot, rajalliset tunnetut sairausmekanismit ja geneettinen heterogeenisyys lisäävät monien sairauksien, kuten DEE:iden, monimutkaisuutta. Siten ratkaisevaa variantin tulkintaa suoritetaan monitieteisissä keskusteluissa geneetikkojen, kliinikkojen, laboratorioteknikkojen ja biostatistikoiden välillä säännöllisten muodollisten genomilautakunnan (GB) istuntojen aikana koko tutkimusjakson ajan.

GBs ovat monialaisia ​​istuntoja, joita isännöi HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), jossa tarkastellaan potilaiden tiedostoja, jotka ovat toistaiseksi välttyneet diagnoosista. Lastenneurologian GB:t kokoavat yhteen neurolastenlääkärit, lastenradiologit, kliiniset geneetit, biologit ja bioinformatikot geenilääketieteen divisioonasta sekä tapausten pyynnöstä muita asiantuntijoita, mm. aikuiset neurologit, laboratoriolääketieteen asiantuntijat, immunologit tai muut asiantuntijat. Yhdessä he tarkastelevat potilaan geneettisiä muunnelmia geeneissä, jotka saattavat selittää taudin, ja joko hylkäävät ne tai ehdottavat ylimääräisten, erittäin kohdennettujen tutkimusten tilaamista fenotyypin jälkikäteen vahvistamiseksi. Jos diagnoosia ei saada, potilas kutsutaan palaamaan klinikalle uutta GB:tä varten 18-24 kuukauden kuluttua. Omat sarjamme osoittavat, että helmikuussa 2019 käyttöönoton jälkeen GB:t ovat antaneet HUG:lle mahdollisuuden nostaa DEE-diagnostiikan tasoaan noin 45 prosentista 55 prosenttiin. GB:t tapahtuvat videoneuvotteluhuoneessa, joka on varustettu potilastietojen turvalliseen ja luottamukselliseen vaihtoon lääketieteen salassa pitkiä matkoja. Potilaiden geneettisistä tiedoista keskustellaan, mutta niitä ei kopioida eikä siirretä keskuksesta toiseen. Tiedot koostuvat luettelosta kohteena olevan WES:n eri geeneissä olevista geneettisistä varianteista, julkisista ja sisäisistä tietokannoista (esim. GnomAD) saaduista huomautuksista sekä bioinformatiikan työkalujen laskelmista (esim. CADD-pisteet). Tyypillisesti neurolastenlääkäri esittelee potilaan kliiniset tiedot, lastenradiologi näyttää ja kommentoi magneettikuvausta, geneetikko esittelee kliinisesti merkitykselliset geenit, jotka kantavat ehdokasvariantteja, ja molekyylidiagnostiikan laboratorioryhmä biologeista ja bioinformaatikoista saa pätevyyden. muunnelmat patogeenisinä, todennäköisesti patogeenisinä tai joiden merkitystä ei tunneta. Jälkimmäisessä tapauksessa ryhmä tarkastelee kirjallisuutta GB:n aikana päättääkseen, voisiko lisätesti varmasti vahvistaa oletetun diagnoosin, eli vahvistaa fenotyypin, joka on aiheuttanut geenin, joka sisältää toistaiseksi merkityksettömäksi luokitellun variantin.

Meillä on asiantuntemusta seuraavan sukupolven sekvensointimenetelmistä, jotka tukevat geneettisten sairauksien kliinistä diagnostiikkaa vuodesta 2012 lähtien, ja toimitamme bioinformatiikan alustoja ja muita translatiivisia SNP-seulontoja, jotka perustuvat genominlaajuisiin assosiaatiotutkimuksiin. Ryhmä on erittäin kiinnostunut Vietnamin genomisen harvinaisten sairauksien tietokannasta.