Investigações genéticas em crianças com encefalopatias epilépticas e de desenvolvimento na cidade de Ho Chi Minh, Vietnã

Com este estudo de coorte prospectivo, desejamos conhecer a proporção de crianças com encefalopatias do desenvolvimento e epilépticas acompanhadas no maior centro de neurologia pediátrica do Vietnã do Sul e matriculadas consecutivamente para as quais investigações genéticas avançadas permitem a identificação de variantes genéticas patogênicas. Esperamos que essa proporção seja de 50%.

Também investigaremos a proporção de crianças nas quais os resultados genéticos permitirão adaptações individualizadas do tratamento e mudanças globais no manejo. Esperamos que essa proporção seja de pelo menos 10%.

Este projeto colaborativo é o primeiro passo para demonstrar a utilidade clínica de procedimentos genéticos de alto rendimento para todos os pacientes com epilepsia grave de início precoce e dificuldades de desenvolvimento no Vietnã. Análises paralelas de sequências de exomas de pacientes no Vietnã e na Suíça permitirão a otimização do procedimento.

Seleção do paciente:

Com base em uma taxa de natalidade de 16.745 crianças/1.000 pessoas no Vietnã (estatísticas de 2018, data.worldbank.org, consultado em 18 de dezembro de 2020), uma taxa de mortalidade de 15,9/1.000 nascidos vivos no Vietnã (estatísticas de 2019, data.worldbank.org, consultado em 18 de dezembro de 2020), um total de 1.394.401 nascidos vivos em todo o país e uma população nacional de 97.752.966, dos quais 8.602.317 vivem em HCMC (estatísticas de 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, consultado em 18 de dezembro de 2020), estimamos que 122.708 a 144.046 crianças nascem na cidade a cada ano, das quais 120.756 a 141.756 permanecerão vivas. Com base em uma incidência geral calculada recentemente de 54/100.000 nascidos vivos no estado de Victoria, Austrália, e uma incidência ajustada por idade comparável de 44,8/100.000 pessoas em Ba Vi, um distrito rural do Vietnã, nós estimam que 54-75 crianças com SEI nascem todos os anos no HCMC. Dado o fato de que a maioria dessas crianças é acompanhada no ND2, e que muitos pacientes com condições neurológicas graves provenientes de uma área mais ampla também consultam no ND2, nosso objetivo é matricular 50 crianças por ano.

Critérios de inclusão: Pacientes consecutivos, atendidos no Hospital ND2 durante o período do estudo, serão convidados a participar do estudo e serão solicitados a assinar um termo de consentimento se preencherem todos os seguintes critérios de inclusão:

1. Epilepsia resistente a medicamentos, desde o início ou no acompanhamento (de acordo com os critérios da ILAE 2010)
2. Atraso ou regressão grave do desenvolvimento, segundo avaliação do neurologista pediátrico (ou quociente de desenvolvimento <50, se avaliado formalmente)
3. Idade de início dos principais sintomas (convulsões, atraso no desenvolvimento): 0-36 meses
4. Concordância em participar do estudo e termo de consentimento assinado Todos os pacientes pré-selecionados serão discutidos em teleconferências mensais entre o hospital Nhi Dong 2 e os hospitais da Universidade de Genebra antes da coleta de sangue. Amostras de sangue serão coletadas dos pacientes e de seus pais, quando disponíveis.

Critérios de exclusão: Pacientes com causas estruturais, infecciosas ou inflamatórias identificadas (como encefalopatia hipóxico-isquêmica perinatal, distúrbios cerebrovasculares, sequelas de trauma ou encefalite, distúrbios neurocutâneos, etc.) não serão convidados a participar do estudo.

Investigações genéticas:

Com base no que precede, pretendemos iniciar nossas investigações genéticas por Whole Exome Sequencing (WES), e manter o cariótipo e o CGH-array para os casos em que nenhuma variante causal for encontrada. WES é um procedimento de várias etapas que inclui extração de DNA, sequenciamento de exoma, processamento e mapeamento, chamada de variante, anotação e priorização, conforme descrito abaixo. Em caso de resultados negativos do WES, a utilidade de realizar testes adicionais será avaliada nas sessões planejadas do Genome Board (GB).

Extração de DNA genômico e sequenciamento de exoma Em resumo, para cada participante e seus pais, 2-5 ml de sangue total serão amostrados e armazenados em tubos revestidos com anticoagulantes K2/K3-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). O DNA genômico será extraído usando um kit DNA Mini Blood Isolation (QIAGEN DmbH, Holanda). A quantidade de DNA será medida pelo Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), um método ultrassensível de coloração de ácido nucleico fluorescente para quantificar DNA de fita dupla, usando fluorometria Victor 3, e a condição do DNA será avaliada por 1% de gel eletroforese para garantir a qualidade e a quantidade de amostras de DNA antes da etapa de sequenciamento.

O sequenciamento completo do exoma tem como alvo todas as regiões codificadoras de proteínas e é responsável por 85% das mutações altamente penetrantes no genoma humano. O sequenciamento completo do exoma será realizado em um laboratório certificado pela CLIA na Macrogen Ltd., Seul, Coréia. As bibliotecas construídas serão sequenciadas usando o kit de captura de exoma Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia, EUA), que utiliza iscas de cRNA biotinilado de 120-mer para capturar e enriquecer regiões de exoma (357.999 exons no total), em um NovaSeq Sistema de sequenciamento 6000 (Illumina, San Diego, CA, EUA).

As sequências de DNA obtidas pelo WES (arquivos FASTQ) serão analisadas "in silico" em paralelo, mas cegas entre si, na cidade de Ho Chi Minh e em Genebra, assim como as decisões para análises adicionais focadas com base na descrição fenotípica (por exemplo, Sanger sequenciamento de alguns exons mal cobertos em genes específicos). Para isso, alíquotas codificadas de pacientes e DNAs dos pais serão transferidas para Genebra.

Processamento e mapeamento de dados brutos Os dados brutos serão analisados ​​na cidade de Ho Chi Minh usando um pipeline interno de bioinformática e de forma independente em Genebra. A qualidade dos dados brutos FASTQ será assegurada pela atribuição de pontuação Phred, conteúdo GC, comprimento de leitura, qualidade de leitura e nível de duplicação de sequência. A etapa de pré-processamento usando o Trimmomatic será aplicada para eliminar quaisquer leituras de baixa qualidade e sequências de contaminantes do adaptador. Os algoritmos de BWA-MEM, PICARD e GATK serão usados ​​para mapeamento e processamento pós-alinhamento adicional, incluindo remoção de duplicatas e recalibração de qualidade básica para marcar ou remover quaisquer artefatos.

Chamada e anotação de variantes Os dados de mapeamento refinados serão posteriormente processados ​​para chamada e anotação de variantes por GATK Haplotype Caller e ANNOVAR. A previsão funcional e a anotação de todos os candidatos em potencial serão realizadas pelo dbNSFP, incluindo 29 algoritmos, 9 pontuações de conservação e informações relacionadas observadas em muitos bancos de dados populacionais, como 1000 Genomes, ExAC, gnomaAD e o projeto de sequenciamento NHLBI Exome ESP6500 Priorização de variantes variantes etiológicas suspeitas filtradas por um painel de epilepsia direcionado de 671 genes serão minuciosamente analisadas de acordo com as recomendações de 2015 do American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). O sequenciamento de Sanger também será usado para validar a segregação familiar de todas as variantes candidatas detectadas, conforme recomendado. As variantes são classificadas em cinco categorias: 1) benignas, 2) provavelmente benignas, 3) significado incerto, 4) provavelmente patogênicas e 5) patogênicas. As variantes com frequências alélicas menores > 0,05 em qualquer um desses bancos de dados: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC e NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) serão filtradas. As análises realizadas incluirão análise computacional de DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Functional Analysis through Hidden Markov Models-MKL coding, Combined annotation-dependent depletion, e EIGEN score.

Os dados de sequência massivos, mecanismos de doença conhecidos limitados e heterogeneidade genética contribuem para a complexidade de muitas condições, como DEEs. Assim, a interpretação variante conclusiva será realizada em discussões multidisciplinares entre geneticistas, clínicos, técnicos de laboratório e bioestatísticos durante sessões formais regulares do genoma board (GB), durante todo o período do estudo.

Os GBs são sessões multidisciplinares organizadas pelo Centro de Medicina Genômica do HUG (CGEM), onde são revisados ​​os arquivos dos pacientes, que até agora não tinham diagnóstico. Os GBs de neurologia pediátrica reúnem neuropediatras, radiologistas pediátricos, geneticistas clínicos, biólogos e bioinformáticos da divisão de Medicina Genética, além de outros especialistas solicitados pelos casos, por exemplo, neurologistas adultos, especialistas em medicina laboratorial, imunologistas ou outros especialistas. Juntos, eles revisam as variantes genéticas do paciente em genes que podem explicar a doença e as rejeitam ou propõem a solicitação de investigações adicionais extremamente focadas para validação a posteriori do fenótipo. Se nenhum diagnóstico puder ser alcançado, o paciente é convidado a voltar à clínica para um novo GB 18-24 meses depois. Nossa série interna mostra que, desde sua implementação em fevereiro de 2019, os GBs permitiram que o HUG aumentasse sua taxa de diagnóstico de DEE de aproximadamente 45% para 55%. Os GBs acontecem em uma sala de videoconferência equipada para a troca segura e confidencial de dados de pacientes sob sigilo médico a longas distâncias. Os dados genéticos dos pacientes são discutidos, mas não copiados nem transferidos de um centro para outro. Os dados consistem em uma lista de variantes genéticas em diferentes genes do WES alvo, com anotações de bancos de dados públicos e internos (por exemplo, GnomAD), juntamente com cálculos de ferramentas de bioinformática (por exemplo, pontuação CADD). Normalmente, o neuropediatra apresentará os dados clínicos do paciente, o radiologista pediátrico mostrará e comentará a ressonância magnética, o geneticista apresentará os genes clinicamente relevantes que carregam variantes candidatas e a equipe de biólogos e bioinformáticos do laboratório de diagnóstico molecular qualificará as variantes como patogênicas, provavelmente patogênicas ou de significado desconhecido. Neste último caso, a equipe revisará a literatura, durante o GB, para decidir se um teste adicional pode definitivamente confirmar um diagnóstico putativo, ou seja, confirmar o fenótipo causado pelo gene portador de uma variante até então qualificada como de significado desconhecido.

Temos experiência em abordagens de sequenciamento de próxima geração para apoiar o diagnóstico clínico de doenças genéticas desde 2012 e fornecemos plataformas de bioinformática e outras triagens SNP translacionais com base em estudos de associação de genoma. A equipe está fortemente interessada em contribuir com o banco de dados genômico vietnamita de doenças raras.