Badania genetyczne u dzieci z encefalopatiami rozwojowymi i epileptycznymi w mieście Ho Chi Minh w Wietnamie

W tym prospektywnym badaniu kohortowym chcemy poznać odsetek dzieci z encefalopatiami rozwojowymi i epileptycznymi obserwowanymi w największej placówce neurologii dziecięcej w Wietnamie Południowym i rejestrowanymi kolejno, dla których zaawansowane badania genetyczne pozwalają na identyfikację patogennych wariantów genów. Spodziewamy się, że ten odsetek wyniesie 50%.

Zbadamy również odsetek dzieci, u których wyniki genetyczne pozwolą na zindywidualizowane dostosowanie leczenia i globalne zmiany zarządzania. Spodziewamy się, że odsetek ten wyniesie co najmniej 10%.

Ten wspólny projekt jest pierwszym krokiem do wykazania klinicznej użyteczności wysokowydajnych procedur genetycznych dla wszystkich pacjentów z ciężką padaczką o wczesnym początku i trudnościami rozwojowymi w Wietnamie. Równoległe analizy sekwencji egzomu pacjentów w Wietnamie i Szwajcarii pozwolą na optymalizację procedury.

Wybór pacjenta:

Na podstawie wskaźnika urodzeń wynoszącego 16 745 dzieci na 1000 osób w Wietnamie (statystyki z 2018 r., data.worldbank.org, konsultowano 18 grudnia 2020 r.), śmiertelność w Wietnamie wynosi 15,9/1'000 żywych urodzeń (statystyki z 2019 r., data.worldbank.org, skonsultowano 18 grudnia 2020 r.), łącznie 1 394 401 urodzeń żywych w całym kraju i ogólnokrajową populację 97 752 966, z czego 8 602 317 mieszka w HCMC (statystyki 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsultowano 18 grudnia 2020 r.), szacujemy, że każdego roku w mieście rodzi się od 122 708 do 144 046 dzieci, z czego 120 756 do 141 756 pozostanie przy życiu. Na podstawie niedawno obliczonej ogólnej częstości występowania wynoszącej 54/100 000 żywych urodzeń w stanie Wiktoria w Australii i porównywalnej z uwzględnieniem wieku częstości występowania wynoszącej 44,8/100 000 osób w Ba Vi, wiejskim okręgu Wietnamu, szacują, że co roku w HCMC rodzi się 54-75 dzieci z SEI. Biorąc pod uwagę fakt, że większość tych dzieci jest obserwowana w ND2 i że wielu pacjentów z ciężkimi schorzeniami neurologicznymi pochodzących z szerszego obszaru również konsultuje się w ND2, naszym celem jest zapisanie 50 dzieci rocznie.

Kryteria włączenia: Kolejni pacjenci leczeni w szpitalu ND2 w okresie badania zostaną poproszeni o wzięcie udziału w badaniu i podpisanie formularza zgody, jeśli spełnią wszystkie poniższe kryteria włączenia:

1. Padaczka lekooporna od początku lub w okresie obserwacji (według kryteriów ILAE 2010)
2. Poważne opóźnienie lub regres rozwojowy, zgodnie z oceną neurologa dziecięcego (lub iloraz rozwojowy <50, jeśli został formalnie oceniony)
3. Wiek wystąpienia głównych objawów (napady padaczkowe, opóźnienie rozwoju): 0-36 miesięcy
4. Zgoda na udział w badaniu i podpisany formularz zgody Wszyscy wstępnie wyselekcjonowani pacjenci będą omawiani podczas comiesięcznych telekonferencji pomiędzy szpitalami Nhi Dong 2 i szpitalami Uniwersytetu Genewskiego przed pobraniem próbek krwi. Próbki krwi będą pobierane od pacjentów i ich rodziców, jeśli będą dostępne.

Kryteria wykluczenia: Pacjenci ze zidentyfikowanymi przyczynami strukturalnymi, zakaźnymi lub zapalnymi (takimi jak okołoporodowa encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna, zaburzenia naczyniowo-mózgowe, następstwa urazu lub zapalenia mózgu, zaburzenia nerwowo-skórne itp.) nie zostaną poproszeni o udział w badaniu.

Badania genetyczne:

W oparciu o to, co poprzedza, zamierzamy rozpocząć nasze badania genetyczne od sekwencjonowania całego egzomu (WES) i zachować kariotypowanie i macierz CGH dla przypadków, w których nie znaleziono wariantu przyczynowego. WES to wieloetapowa procedura, która obejmuje ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie egzomu, przetwarzanie i mapowanie, wywoływanie wariantów, adnotację i ustalanie priorytetów, jak opisano poniżej. W przypadku negatywnego wyniku WES celowość wykonania dalszych badań zostanie oceniona na planowanych sesjach Genome Board (GB).

Ekstrakcja genomowego DNA i sekwencjonowanie egzomu W skrócie, od każdego uczestnika i obojga jego/jej rodziców zostanie pobrane 2-5 ml pełnej krwi i przechowywane w probówkach pokrytych antykoagulantami z kwasem K2/K3-etylenodiaminotetraoctowym (EDTA). Genomowy DNA zostanie wyekstrahowany przy użyciu zestawu do izolacji DNA Mini Blood Isolation (QIAGEN DmbH, Holandia). Ilość DNA zostanie zmierzona za pomocą zestawu Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), ultraczułej metody barwienia fluorescencyjnego kwasu nukleinowego do ilościowego oznaczania dwuniciowego DNA przy użyciu fluorometrii Victor 3, a stan DNA zostanie oceniony za pomocą 1% żelu elektroforeza w celu zapewnienia jakości i ilości próbek DNA przed etapem sekwencjonowania.

Sekwencjonowanie całego egzomu celuje we wszystkie regiony kodujące białka i odpowiada za 85% wysoce penetrujących mutacji w ludzkim genomie. Sekwencjonowanie całego egzomu zostanie przeprowadzone w certyfikowanym przez CLIA laboratorium w Macrogen Ltd., Seul, Korea. Skonstruowane biblioteki zostaną zsekwencjonowane przy użyciu zestawu do przechwytywania egzomu Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA), który wykorzystuje 120-merowe biotynylowane przynęty cRNA do wychwytywania i wzbogacania regionów egzomu (łącznie 357 999 egzonów), na NovaSeq system sekwencjonowania 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA).

Sekwencje DNA uzyskane za pomocą WES (pliki FASTQ) będą analizowane „in silico” równolegle, ale ślepo względem siebie, w Ho Chi Minh City i Genewie, podobnie jak decyzje dotyczące dodatkowych, ukierunkowanych analiz opartych na opisie fenotypowym (np. Sekwencjonowanie Sangera niektórych słabo pokrytych eksonów w określonych genach). W tym celu zakodowane próbki DNA pacjentów i rodziców zostaną przetransportowane do Genewy.

Przetwarzanie i mapowanie surowych danych Surowe dane będą analizowane w Ho Chi Minh City przy użyciu wewnętrznego rurociągu bioinformatycznego oraz niezależnie w Genewie. Jakość surowych danych FASTQ zostanie zapewniona przez przypisanie wyniku Phred, zawartość GC, długość odczytu, jakość odczytu i poziom duplikacji sekwencji. Etap wstępnego przetwarzania przy użyciu Trimmomatic zostanie zastosowany w celu usunięcia wszelkich odczytów niskiej jakości i sekwencji zanieczyszczeń adaptera. Algorytmy BWA-MEM, PICARD i GATK zostaną użyte do mapowania i dodatkowego przetwarzania po wyrównaniu, w tym usuwania duplikatów i ponownej kalibracji jakości bazowej w celu oznaczenia lub usunięcia wszelkich artefaktów.

Wywoływanie i adnotacje wariantów Udoskonalone dane mapowania będą następnie dalej przetwarzane w celu wywołania wariantów i adnotacji przez GATK Haplotype Caller i ANNOVAR. Funkcjonalne przewidywanie i adnotacja wszystkich potencjalnych kandydatów zostanie następnie przeprowadzona przez dbNSFP, w tym 29 algorytmów, 9 ocen ochrony i powiązanych informacji obserwowanych w wielu bazach danych populacji, takich jak 1000 genomów, ExAC, gnomAD i projekt sekwencjonowania egzomu NHLBI ESP6500 Priorytetyzacja wariantów podejrzane warianty etiologiczne przefiltrowane przez ukierunkowany panel padaczki składający się z 671 genów zostaną dokładnie przeanalizowane zgodnie z zaleceniami American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) z 2015 roku. Sekwencjonowanie Sangera zostanie również wykorzystane do sprawdzenia segregacji rodziny wszystkich wykrytych wariantów kandydujących, zgodnie z zaleceniami. Warianty są podzielone na pięć kategorii: 1) łagodne, 2) prawdopodobnie łagodne, 3) niepewne znaczenie, 4) prawdopodobnie patogenne i 5) patogenne. Warianty o częstości mniejszych alleli > 0,05 w dowolnej z tych baz danych: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC i NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) zostaną odfiltrowane. Przeprowadzone analizy będą obejmować analizę obliczeniową DANN, profilowanie tempa ewolucji genomu++, test współczynnika wiarygodności, tester mutacji, analizę funkcjonalną poprzez kodowanie ukrytych modeli Markowa-MKL, połączone wyczerpanie zależne od adnotacji i wynik EIGEN.

Ogromne dane dotyczące sekwencji, ograniczone znane mechanizmy chorobowe i heterogeniczność genetyczna przyczyniają się do złożoności wielu schorzeń, takich jak DEE. W związku z tym ostateczna interpretacja wariantów zostanie przeprowadzona w multidyscyplinarnych dyskusjach wśród genetyków, klinicystów, techników laboratoryjnych i biostatystyków podczas regularnych sesji formalnej rady genomu (GB) przez cały okres badania.

GB to multidyscyplinarne sesje organizowane przez HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), podczas których przeglądane są akta pacjentów, którzy do tej pory wymykali się diagnozie. GB neurologii dziecięcej tworzą neuropediatrzy, radiologowie dziecięcy, genetycy kliniczni, biolodzy i bioinformatycy z Oddziału Medycyny Genetycznej, a także inni specjaliści zgodnie z wymaganiami przypadków, m.in. dorosłych neurologów, specjalistów medycyny laboratoryjnej, immunologów lub innych specjalistów. Wspólnie dokonują przeglądu wariantów genetycznych pacjenta w genach, które mogą wyjaśniać chorobę, i albo je odrzucają, albo proponują zamówienie dodatkowych, niezwykle ukierunkowanych badań w celu walidacji fenotypu a posteriori. Jeśli nie można postawić diagnozy, pacjent jest proszony o ponowne zgłoszenie się do kliniki po 18-24 miesiącach w celu wykonania nowego GB. Nasza wewnętrzna seria pokazuje, że od czasu wdrożenia w lutym 2019 r. GB umożliwiły HUG zwiększenie wskaźnika diagnostyki DEE z około 45% do 55%. GB odbywają się w sali wideokonferencyjnej wyposażonej do bezpiecznej i poufnej wymiany danych pacjentów objętych tajemnicą lekarską na duże odległości. Dane genetyczne pacjentów są omawiane, ale nie kopiowane ani przenoszone z jednego ośrodka do drugiego. Dane składają się z listy wariantów genetycznych w różnych genach docelowego WES, z adnotacjami z publicznych i wewnętrznych baz danych (np. GnomAD) wraz z obliczeniami z narzędzi bioinformatycznych (np. wynik CADD). Zazwyczaj neuropediatra przedstawi dane kliniczne pacjenta, radiolog dziecięcy pokaże i skomentuje MRI, genetyk przedstawi klinicznie istotne geny niosące warianty kandydujące, a zespół biologów i bioinformatyków laboratorium diagnostyki molekularnej zakwalifikuje warianty jako patogenne, prawdopodobnie patogenne lub o nieznanym znaczeniu. W tym drugim przypadku zespół dokona przeglądu literatury podczas GB, aby zdecydować, czy dodatkowe badanie może ostatecznie potwierdzić domniemaną diagnozę, tj. potwierdzić fenotyp spowodowany przez gen niosący wariant kwalifikowany do tej pory jako o nieznanym znaczeniu.

Od 2012 roku mamy doświadczenie w metodach sekwencjonowania nowej generacji wspierających diagnostykę kliniczną chorób genetycznych i dostarczamy platformy bioinformatyczne oraz inne translacyjne badania przesiewowe SNP oparte na badaniach asocjacyjnych całego genomu. Zespół jest bardzo zainteresowany współtworzeniem wietnamskiej genomowej bazy danych rzadkich chorób.