Indagini genetiche su bambini con encefalopatie epilettiche e dello sviluppo a Ho Chi Minh City, Vietnam

Con questo studio prospettico di coorte, desideriamo conoscere la percentuale di bambini con encefalopatie epilettiche e dello sviluppo seguiti presso la più grande struttura di neurologia pediatrica del Vietnam del Sud e arruolati consecutivamente per i quali indagini genetiche avanzate consentono l'identificazione di varianti genetiche patogene. Ci aspettiamo che questa percentuale sia del 50%.

Indagheremo anche sulla proporzione di bambini in cui i risultati genetici consentiranno adattamenti terapeutici individualizzati e cambiamenti di gestione globali. Prevediamo che questa percentuale sia almeno del 10 %.

Questo progetto collaborativo è il primo passo per dimostrare l'utilità clinica delle procedure genetiche ad alto rendimento per tutti i pazienti con grave epilessia ad esordio precoce e difficoltà di sviluppo in Viet Nam. Analisi parallele delle sequenze dell'esoma dei pazienti in Vietnam e Svizzera consentiranno l'ottimizzazione della procedura.

Selezione del paziente:

Sulla base di un tasso di natalità di 16.745 bambini/1000 persone in Vietnam (statistiche 2018, data.worldbank.org, consultato il 18 dicembre 2020), un tasso di mortalità di 15,9/1'000 nati vivi in ​​Vietnam (statistiche 2019, data.worldbank.org, consultato il 18 dicembre 2020), un totale di 1'394'401 nati vivi in ​​tutto il paese e una popolazione nazionale di 97'752'966 di cui 8'602'317 vivono a HCMC (statistiche 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, consultato il 18 dicembre 2020), stimiamo che in città nascano ogni anno da 122'708 a 144'046 bambini, di cui da 120'756 a 141'756 rimarranno in vita. Sulla base di un'incidenza generale recentemente calcolata di 54/100'000 nati vivi nello Stato di Victoria, Australia, e di un'incidenza comparabile corretta per l'età di 44,8/100'000 persone a Ba Vi, un distretto rurale del Vietnam, abbiamo stima che 54-75 bambini con SEI nascano ogni anno a HCMC. Dato che la maggior parte di questi bambini è seguita presso ND2 e che molti pazienti con gravi condizioni neurologiche provenienti da un'area più ampia consultano anche presso ND2, il nostro obiettivo è di iscrivere 50 bambini all'anno.

Criteri di inclusione: ai pazienti consecutivi, trattati presso l'ospedale ND2 durante il periodo di studio, verrà chiesto di prendere parte allo studio e verrà richiesto di firmare un modulo di consenso se soddisfano tutti i seguenti criteri di inclusione:

1. Epilessia resistente ai farmaci, sia dall'inizio che al follow-up (secondo i criteri ILAE 2010)
2. Grave ritardo o regressione dello sviluppo, secondo la valutazione del neurologo pediatrico (o quoziente di sviluppo <50, se valutato formalmente)
3. Età di insorgenza dei sintomi principali (convulsioni, ritardo dello sviluppo): 0-36 mesi
4. Accordo per partecipare allo studio e modulo di consenso firmato Tutti i pazienti preselezionati saranno discussi in teleconferenze mensili tra l'ospedale Nhi Dong 2 e gli ospedali universitari di Ginevra prima che vengano prelevati i campioni di sangue. Verranno prelevati campioni di sangue dai pazienti e da entrambi i genitori, quando disponibili.

Criteri di esclusione: I pazienti con cause strutturali, infettive o infiammatorie identificate (come encefalopatia ipossico-ischemica perinatale, disturbi cerebrovascolari, sequele di traumi o encefalite, disturbi neurocutanei, ecc...) non saranno invitati a partecipare allo studio.

Indagini genetiche:

Sulla base di quanto precede, intendiamo iniziare le nostre indagini genetiche mediante Whole Exome Sequencing (WES), e mantenere il cariotipo e l'array CGH per i casi in cui non viene trovata alcuna variante causale. WES è una procedura in più fasi che include l'estrazione del DNA, il sequenziamento dell'esoma, l'elaborazione e la mappatura, l'identificazione delle varianti, l'annotazione e l'assegnazione delle priorità, come descritto di seguito. In caso di risultati WES negativi, l'utilità di eseguire ulteriori test sarà valutata nelle sessioni pianificate del Genome Board (GB).

Estrazione del DNA genomico e sequenziamento dell'esoma In breve, per ogni partecipante e per entrambi i suoi genitori, verranno prelevati 2-5 ml di sangue intero e conservati in provette rivestite con anticoagulanti K2/K3-acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Il DNA genomico sarà estratto utilizzando un DNA Mini Blood Isolation kit (QIAGEN DmbH, Paesi Bassi). La quantità di DNA sarà misurata mediante Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), un metodo di colorazione dell'acido nucleico fluorescente ultra sensibile per quantificare il DNA a doppio filamento, utilizzando la fluorometria Victor 3, e la condizione del DNA sarà valutata mediante gel all'1% elettroforesi per garantire la qualità e la quantità dei campioni di DNA prima della fase di sequenziamento.

Il sequenziamento dell'intero esoma prende di mira tutte le regioni codificanti proteine ​​e rappresenta l'85% delle mutazioni altamente penetranti nel genoma umano. Il sequenziamento dell'intero esoma verrà eseguito in un laboratorio certificato CLIA presso Macrogen Ltd., Seoul, Corea. Le librerie costruite saranno sequenziate utilizzando il kit di cattura dell'esoma Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), che utilizza esche di cRNA biotinilato da 120 mer per catturare e arricchire le regioni dell'esoma (357.999 esoni in totale), su un NovaSeq Sistema di sequenziamento 6000 (Illumina, San Diego, CA, USA).

Le sequenze di DNA ottenute da WES (file FASTQ) saranno analizzate "in silico" in parallelo, ma in cieco l'una con l'altra, a Ho Chi Minh City e a Ginevra, così come le decisioni per ulteriori analisi mirate basate sulla descrizione fenotipica (ad esempio, Sequenziamento di Sanger di alcuni esoni scarsamente coperti in geni specifici). A tal fine, aliquote codificate di pazienti e DNA dei genitori saranno trasferite a Ginevra.

Elaborazione e mappatura dei dati grezzi I dati grezzi saranno analizzati a Ho Chi Minh City utilizzando una pipeline bioinformatica interna e in modo indipendente a Ginevra. La qualità dei dati grezzi FASTQ sarà garantita dall'assegnazione del punteggio Phred, dal contenuto GC, dalla lunghezza di lettura, dalla qualità di lettura e dal livello di duplicazione della sequenza. Verrà applicata la fase di pre-elaborazione che utilizza Trimmomatic per eliminare eventuali letture di bassa qualità e sequenze di contaminanti dell'adattatore. Gli algoritmi di BWA-MEM, PICARD e GATK verranno utilizzati per la mappatura e l'ulteriore elaborazione post-allineamento, inclusa la rimozione di duplicati e la ricalibrazione della qualità di base per contrassegnare o rimuovere eventuali artefatti.

Identificazione e annotazione delle varianti I dati di mappatura rifiniti verranno quindi ulteriormente elaborati per l'identificazione e l'annotazione delle varianti da GATK Haplotype Caller e ANNOVAR. La previsione funzionale e l'annotazione di tutti i potenziali candidati saranno quindi eseguite da dbNSFP, inclusi 29 algoritmi, 9 punteggi di conservazione e informazioni correlate osservate in molti database di popolazioni come 1000 Genomes, ExAC, gnomAD e il progetto di sequenziamento dell'esoma NHLBI ESP6500 Prioritizzazione delle varianti Il le sospette varianti eziologiche filtrate da un pannello di epilessia mirato di 671 geni saranno analizzate a fondo secondo le raccomandazioni del 2015 dell'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Il sequenziamento di Sanger verrà utilizzato anche per convalidare la segregazione familiare di tutte le varianti candidate rilevate, come raccomandato. Le varianti sono classificate in cinque categorie: 1) benigne, 2) probabilmente benigne, 3) significato incerto, 4) probabilmente patogene e 5) patogene. Le varianti con frequenze alleliche minori >0,05 in uno qualsiasi di questi database: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC e NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) verranno filtrate. Le analisi eseguite includeranno l'analisi computazionale di DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Functional Analysis through Hidden Markov Models-MKL coding, Combined annotation-dependent depletion e punteggio EIGEN.

I dati di sequenza massiccia, i meccanismi di malattia noti limitati e l'eterogeneità genetica contribuiscono alla complessità di molte condizioni, come i DEE. Pertanto, l'interpretazione conclusiva delle varianti sarà condotta in discussioni multidisciplinari tra genetisti, clinici, tecnici di laboratorio e biostatistici durante le regolari sessioni formali del Genome Board (GB), durante il periodo di studio.

I GB sono sessioni multidisciplinari ospitate dal HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), in cui vengono esaminati i file dei pazienti, che finora hanno eluso la diagnosi. I GB di neurologia pediatrica riuniscono neuropediatri, radiologi pediatrici, genetisti clinici, biologi e bioinformatici della divisione di medicina genetica, nonché altri specialisti richiesti dai casi, ad es. neurologi adulti, specialisti in medicina di laboratorio, immunologi o altri specialisti. Insieme, esaminano le varianti genetiche del paziente nei geni che potrebbero spiegare la malattia, e le respingono o propongono di ordinare ulteriori indagini estremamente mirate per la convalida a posteriori del fenotipo. Se non può essere raggiunta alcuna diagnosi, il paziente è invitato a tornare in clinica per un nuovo GB 18-24 mesi dopo. La nostra serie interna mostra che, da quando sono stati implementati nel febbraio 2019, i GB hanno consentito all'HUG di aumentare il suo tasso diagnostico di DEE da circa il 45% al ​​55%. I GB si svolgono in una sala di videoconferenza attrezzata per lo scambio sicuro e confidenziale dei dati dei pazienti sotto segreto medico su lunghe distanze. I dati genetici dei pazienti vengono discussi ma non copiati né trasferiti da un centro all'altro. I dati consistono in un elenco di varianti genetiche in diversi geni del WES mirato, con annotazioni da database pubblici e interni (ad esempio, GnomAD) insieme a calcoli da strumenti di bioinformatica (ad esempio, punteggio CADD). Tipicamente, il neuropediatra presenterà i dati clinici del paziente, il radiologo pediatrico mostrerà e commenterà la risonanza magnetica, il genetista presenterà i geni clinicamente rilevanti che portano varianti candidate e il team del laboratorio di diagnostica molecolare di biologi e bioinformatici si qualificherà le varianti come patogene, probabilmente patogene o di significato sconosciuto. In quest'ultimo caso, il team esaminerà la letteratura, durante il GB, per decidere se un ulteriore test possa confermare definitivamente una diagnosi presunta, cioè confermare il fenotipo causato dal gene che porta una variante finora qualificata come di significato sconosciuto.

Abbiamo esperienza negli approcci di sequenziamento di nuova generazione per supportare la diagnostica clinica delle malattie genetiche dal 2012 e fornisce piattaforme bioinformatiche e altri screening SNP traslazionali basati su studi di associazione sull'intero genoma. Il team è fortemente interessato a contribuire al database delle malattie rare genomiche vietnamite.