Генетические исследования у детей с развивающейся и эпилептической энцефалопатией в Хошимине, Вьетнам

С помощью этого проспективного когортного исследования мы хотели бы узнать долю детей с энцефалопатиями развития и эпилептической энцефалопатией, наблюдаемых в крупнейшем педиатрическом неврологическом учреждении в Южном Вьетнаме и последовательно зарегистрированных, для которых расширенные генетические исследования позволяют идентифицировать варианты патогенных генов. Мы ожидаем, что эта доля составит 50%.

Мы также изучим долю детей, у которых генетические результаты позволят адаптировать индивидуальную терапию и изменить глобальное лечение. Мы ожидаем, что эта доля составит не менее 10 %.

Этот совместный проект является первым шагом к демонстрации клинической пользы высокопроизводительных генетических процедур для всех пациентов с тяжелой эпилепсией с ранним началом и проблемами развития во Вьетнаме. Параллельный анализ экзомных последовательностей пациентов во Вьетнаме и Швейцарии позволит оптимизировать процедуру.

Выбор пациента:

Исходя из коэффициента рождаемости 16 745 детей на 1000 человек во Вьетнаме (статистика 2018 г., data.worldbank.org, консультации 18 декабря 2020 г.), уровень смертности во Вьетнаме составляет 15,9 на 1000 живорождений (статистика 2019 г., data.worldbank.org, по состоянию на 18 декабря 2020 г.), в общей сложности 1 394 401 живорождений по всей стране, а население страны составляет 97 752 966 человек, из которых 8 602 317 человек проживают в Хошимине (статистика 2020 г., worldometers.info, worldpopulationreview.org, консультации 18 декабря 2020 г.), по нашим оценкам, ежегодно в городе рождается от 122 708 до 144 046 детей, из которых от 120 756 до 141 756 детей останутся в живых. На основе недавно подсчитанной общей заболеваемости в 54 случая на 100 000 живорождений в штате Виктория, Австралия, и сопоставимой заболеваемости с поправкой на возраст в 44,8 случая на 100 000 человек в Бави, сельском районе Вьетнама, мы По оценкам, ежегодно в Хошимине рождается 54–75 детей с СЭИ. Учитывая тот факт, что большинство этих детей наблюдаются в ND2, и что многие пациенты с тяжелыми неврологическими заболеваниями, прибывающие из более широкого региона, также консультируются в ND2, наша цель состоит в том, чтобы зачислять 50 детей в год.

Критерии включения: последовательных пациентов, проходивших лечение в больнице ND2 в течение периода исследования, попросят принять участие в исследовании и подписать форму согласия, если они соответствуют всем следующим критериям включения:

1. Лекарственно-резистентная эпилепсия с самого начала или при последующем наблюдении (согласно критериям ILAE 2010)
2. Серьезная задержка развития или регрессия, согласно оценке детского невролога (или коэффициент развития <50, если проводится формальная оценка)
3. Возраст появления основных симптомов (судороги, задержка развития): 0–36 месяцев.
4. Согласие на участие в исследовании и подписанная форма согласия Все предварительно отобранные пациенты будут обсуждаться на ежемесячных телеконференциях между больницей Нхи Донг 2 и больницами Женевского университета до взятия образцов крови. Образцы крови будут взяты у пациентов и их обоих родителей, если таковые имеются.

Критерии исключения: пациенты с выявленными структурными, инфекционными или воспалительными причинами (такими как перинатальная гипоксически-ишемическая энцефалопатия, цереброваскулярные нарушения, последствия травмы или энцефалита, нервно-кожные расстройства и т. д.) не будут приглашены для участия в исследовании.

Генетические исследования:

Основываясь на том, что предшествует, мы намерены начать наши генетические исследования с секвенирования полного экзома (WES) и продолжить кариотипирование и CGH-матрицу для случаев, в которых причинный вариант не обнаружен. WES — это многоэтапная процедура, включающая извлечение ДНК, секвенирование экзома, обработку и картирование, определение вариантов, аннотацию и определение приоритетов, как описано ниже. В случае отрицательных результатов WES полезность проведения дальнейших тестов будет оцениваться на запланированных заседаниях Совета генома (GB).

Экстракция геномной ДНК и секвенирование экзома Вкратце, у каждого участника и обоих его/ее родителей будет взято 2-5 мл цельной крови, которая будет храниться в пробирках, покрытых антикоагулянтами К2/К3-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Геномная ДНК будет извлечена с использованием набора для выделения ДНК Mini Blood Isolation (QIAGEN DmbH, Нидерланды). Количество ДНК будет измеряться с помощью набора для анализа двухцепочечной ДНК Quant-iTTM PicoGreenTM (Invitrogen), сверхчувствительного метода флуоресцентного окрашивания нуклеиновых кислот для количественного определения двухцепочечной ДНК с использованием флуорометра Victor 3, а состояние ДНК будет оцениваться с помощью 1% геля. электрофорез для обеспечения качества и количества образцов ДНК перед этапом секвенирования.

Секвенирование полного экзома нацелено на все регионы, кодирующие белок, и на его долю приходится 85% мутаций с высокой проникающей способностью в геноме человека. Полное секвенирование экзома будет проводиться в сертифицированной CLIA лаборатории Macrogen Ltd., Сеул, Корея. Сконструированные библиотеки будут секвенированы с использованием набора для захвата экзома Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), который использует 120-мерные биотинилированные кРНК-приманки для захвата и обогащения экзомных областей (всего 357 999 экзонов) на NovaSeq. Система секвенирования 6000 (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США).

Последовательности ДНК, полученные с помощью WES (файлы FASTQ), будут анализироваться «in silico» параллельно, но вслепую относительно друг друга, в Хошимине и Женеве, как и решения о проведении дополнительных целенаправленных анализов на основе фенотипического описания (например, секвенирование по Сэнгеру некоторых плохо покрытых экзонов в определенных генах). С этой целью в Женеву будут переданы закодированные аликвоты ДНК пациентов и родителей.

Обработка и картирование первичных данных. Исходные данные будут анализироваться в Хошимине с использованием внутренней системы биоинформатики и независимо в Женеве. Качество необработанных данных FASTQ будет обеспечиваться присвоением балла Phred, содержанием GC, длиной считывания, качеством считывания и уровнем дублирования последовательности. Этап предварительной обработки с использованием Trimmomatic будет применяться для удаления любых некачественных считываний и последовательностей загрязнений адаптера. Алгоритмы BWA-MEM, PICARD и GATK будут использоваться для картирования и дополнительной обработки после выравнивания, включая удаление дубликатов и повторную калибровку базового качества для маркировки или удаления любых артефактов.

Вызов варианта и аннотация Уточненные данные картирования будут затем обработаны для вызова варианта и аннотации с помощью GATK Haplotype Caller и ANNOVAR. Затем dbNSFP будет выполнять функциональное прогнозирование и аннотацию всех потенциальных кандидатов, включая 29 алгоритмов, 9 оценок сохранения и соответствующую информацию, наблюдаемую во многих базах данных населения, таких как 1000 Genomes, ExAC, gnomAD и проект секвенирования экзома NHLBI ESP6500. предполагаемые этиологические варианты, отфильтрованные с помощью целевой панели эпилепсии из 671 гена, будут тщательно проанализированы в соответствии с рекомендациями 2015 года Американского колледжа медицинской генетики и геномики (ACMG). Секвенирование по Сэнгеру также будет использоваться для проверки семейной сегрегации всех обнаруженных вариантов-кандидатов, как это рекомендовано. Варианты подразделяются на пять категорий: 1) доброкачественные, 2) вероятно доброкачественные, 3) неопределенное значение, 4) вероятно патогенные и 5) патогенные. Варианты с частотами минорных аллелей> 0,05 в любой из этих баз данных: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC и NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) будут отфильтрованы. Выполненные анализы будут включать вычислительный анализ DANN, профилирование скорости эволюции генома ++, тест отношения правдоподобия, дегустатор мутаций, функциональный анализ с помощью скрытых марковских моделей-кодирование MKL, комбинированное истощение, зависящее от аннотации, и оценка EIGEN.

Огромные данные о последовательностях, ограниченные известные механизмы заболевания и генетическая гетерогенность способствуют сложности многих состояний, таких как DEE. Таким образом, окончательная интерпретация вариантов будет проводиться в междисциплинарных дискуссиях между генетиками, клиницистами, лаборантами и биостатистиками во время регулярных заседаний формального совета по геному (GB) в течение всего периода исследования.

GB — это междисциплинарные сеансы, проводимые Центром геномной медицины HUG (CGEM), на которых просматриваются файлы пациентов, которым до сих пор не удавалось поставить диагноз. В ГБ детской неврологии входят нейропедиатры, детские рентгенологи, клинические генетики, биологи и биоинформатики из отдела генетической медицины, а также другие специалисты по запросу, например. взрослые неврологи, специалисты лабораторной медицины, иммунологи или другие специалисты. Вместе они рассматривают генетические варианты пациента в генах, которые могут объяснить заболевание, и либо отвергают их, либо предлагают заказать дополнительные, чрезвычайно целенаправленные исследования для апостериорной проверки фенотипа. Если диагноз не может быть поставлен, пациенту предлагается вернуться в клинику для новой ГБ через 18-24 месяца. Наши внутренние серии показывают, что с момента внедрения в феврале 2019 года ГБ позволили HUG увеличить уровень диагностики DEE примерно с 45% до 55%. ГБ проходят в помещении для видеоконференций, оборудованном для безопасного и конфиденциального обмена данными пациентов в условиях врачебной тайны на большие расстояния. Генетические данные пациентов обсуждаются, но не копируются и не передаются из одного центра в другой. Данные состоят из списка генетических вариантов в различных генах целевого WES с аннотациями из общедоступных и внутренних баз данных (например, GnomAD), а также расчетов с помощью инструментов биоинформатики (например, оценка CADD). Как правило, нейропедиатр представляет клинические данные пациента, детский радиолог показывает и комментирует МРТ, генетик представляет клинически значимые гены, которые несут варианты-кандидаты, а группа биологов и биоинформатиков лаборатории молекулярной диагностики проводит квалификацию. варианты как патогенные, вероятно патогенные или имеющие неизвестное значение. В последнем случае команда изучит литературу во время ГБ, чтобы решить, может ли дополнительный тест определенно подтвердить предполагаемый диагноз, т. Е. Подтвердить фенотип, вызванный геном, несущим вариант, до сих пор определяемый как неизвестный. значимость.

Мы обладаем опытом в области подходов секвенирования нового поколения для поддержки клинической диагностики генетических заболеваний с 2012 года и поставляем биоинформатические платформы и другие трансляционные скрининги SNP на основе полногеномных ассоциативных исследований. Команда очень заинтересована в создании вьетнамской геномной базы данных по редким заболеваниям.