Genetiske undersøkelser hos barn med utviklingsmessige og epileptiske encefalopatier i Ho Chi Minh-byen, Vietnam

Med denne prospektive kohortstudien ønsker vi å vite andelen barn med utviklingsmessige og epileptiske encefalopatier som følges ved det største pediatriske nevrologiske anlegget i Sør-Vietnam og som er registrert fortløpende for hvem avanserte genetiske undersøkelser tillater identifisering av patogene genvarianter. Vi forventer at denne andelen vil være 50 %.

Vi vil også undersøke andelen barn der de genetiske resultatene vil tillate individualiserte behandlingstilpasninger og globale ledelsesendringer. Vi forventer at denne andelen vil være minst 10 %.

Dette samarbeidsprosjektet er det første trinnet for å demonstrere den kliniske nytten av genetiske prosedyrer med høy gjennomstrømning for alle pasienter med alvorlig tidlig debut epilepsi og utviklingsvansker i Vietnam. Parallelle analyser av pasientenes eksomsekvenser i Vietnam og Sveits vil tillate optimalisering av prosedyren.

Pasientvalg:

Basert på en fødselsrate på 16.745 barn/1000 mennesker i Vietnam (2018-statistikk, data.worldbank.org, konsultert 18. desember 2020), en dødelighet på 15,9/1000 levendefødte i Vietnam (2019-statistikk, data.worldbank.org, konsultert 18. desember 2020), totalt 1'394'401 levendefødte i hele landet, og en landsdekkende befolkning på 97'752'966, hvorav 8'602'317 bor i HCMC (2020-statistikk, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsultert 18. desember 2020), anslår vi at 122.708 til 144.046 barn blir født i byen hvert år, hvorav 120.756 til 141.756 vil holde seg i live. På grunnlag av en nylig beregnet generell forekomst på 54/100.000 levendefødte i staten Victoria, Australia, og en sammenlignbar aldersjustert forekomst på 44,8/100.000 personer i Ba Vi, et landlig distrikt i Vietnam, har vi anslå at 54-75 barn med SEI blir født hvert år i HCMC. Gitt det faktum at et flertall av disse barna følges på ND2, og at mange pasienter med alvorlige nevrologiske tilstander som kommer fra et bredere område også konsulterer på ND2, er vårt mål å registrere 50 barn per år.

Inklusjonskriterier: Påfølgende pasienter, behandlet ved ND2 sykehus i løpet av studieperioden, vil bli bedt om å delta i studien og vil bli bedt om å signere et samtykkeskjema dersom de oppfyller alle følgende inklusjonskriterier:

1. Legemiddelresistent epilepsi, enten fra starten eller ved oppfølging (i henhold til ILAE 2010-kriterier)
2. Alvorlig utviklingsforsinkelse eller regresjon, i henhold til pediatrisk nevrologevaluering (eller utviklingskvotient <50, hvis formelt vurdert)
3. Alder for debut av hovedsymptomer (anfall, utviklingsforsinkelse): 0-36 måneder
4. Avtale om å delta i studien og signert samtykkeskjema Alle de forhåndsutvalgte pasientene vil bli diskutert i månedlige telekonferanser mellom Nhi Dong 2 sykehus og Genève universitetssykehus før blodprøver tas. Blodprøver vil bli tatt fra pasientene og begge foreldrene deres, når tilgjengelig.

Eksklusjonskriterier: Pasienter med identifiserte strukturelle, infeksiøse eller inflammatoriske årsaker (som perinatal hypoksisk-iskemisk encefalopati, cerebrovaskulære lidelser, sekvele etter traumer eller encefalitt, nevrokutane lidelser, etc...) vil ikke bli bedt om å delta i studien.

Genetiske undersøkelser:

Basert på det som går foran, har vi til hensikt å starte våre genetiske undersøkelser med Whole Exome Sequencing (WES), og beholde karyotyping og CGH-array for tilfeller der ingen årsaksvariant er funnet. WES er en flertrinnsprosedyre som inkluderer DNA-ekstraksjon, eksomsekvensering, prosessering og kartlegging, variantkalling, annotering og prioritering, som beskrevet nedenfor. I tilfelle negative WES-resultater, vil nytten av å utføre ytterligere tester bli evaluert i de planlagte Genome Board (GB)-sesjonene.

Genomisk DNA-ekstraksjon og eksomsekvensering Kort fortalt, for hver deltaker og begge hans/hennes foreldre, vil 2-5 ml fullblod bli tatt prøver av og lagret i rør belagt med K2/K3-Ethylendiaminetetraeddiksyre (EDTA) antikoagulanter. Genomisk DNA vil bli ekstrahert ved hjelp av et DNA Mini Blood Isolation kit (QIAGEN DmbH, Nederland). DNA-mengde vil bli målt med Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), en ultrasensitiv fluorescerende nukleinsyrefargemetode for kvantifisering av dobbelttrådet DNA, ved bruk av Victor 3 fluorometri, og tilstanden til DNA vil bli vurdert med 1 % gel elektroforese for å sikre kvaliteten og kvantiteten av DNA-prøver før sekvenseringstrinnet.

Whole Exome Sequencing retter seg mot alle proteinkodende regioner og står for 85 % av svært penetrerende mutasjoner i det menneskelige genomet. Whole Exome Sequencing vil bli utført i et CLIA-sertifisert laboratorium ved Macrogen Ltd., Seoul, Korea. De konstruerte bibliotekene vil bli sekvensert ved å bruke Agilent SureSelect V5-eksomfangstsettet (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), som bruker 120-mer biotinylert cRNA-agn for å fange opp og berike eksomregioner (totalt 357 999 eksoner), på en NovaSeq 6000 sekvenseringssystem (Illumina, San Diego, CA, USA).

DNA-sekvenser oppnådd av WES (FASTQ-filer) vil bli analysert "in silico" parallelt, men blindet for hverandre, i Ho Chi Minh-byen og i Genève, og det samme vil beslutninger om ytterligere, fokuserte analyser basert på den fenotypiske beskrivelsen (f.eks. Sanger-sekvensering av noen dårlig dekkede eksoner i spesifikke gener). For det formål vil kodede alikvoter av pasienter og foreldrenes DNA overføres til Genève.

Rådatabehandling og kartlegging Rådata vil bli analysert i Ho Chi Minh-byen ved hjelp av en intern bioinformatikk-pipeline, og uavhengig i Genève. Kvaliteten på FASTQ-rådata vil bli sikret ved tildeling av Phred-score, GC-innhold, leselengde, lesekvalitet og sekvensdupliseringsnivå. Forbehandlingstrinn ved bruk av Trimmomatic vil bli brukt for å trimme ut eventuelle avlesninger av lav kvalitet og adapterforurensningssekvenser. Algoritmene til BWA-MEM, PICARD og GATK vil bli brukt til kartlegging og ytterligere etterjusteringsbehandling, inkludert fjerning av duplikater og rekalibrering av basekvalitet for å merke eller fjerne eventuelle artefakter.

Variantkall og merknad De raffinerte kartdataene vil deretter bli viderebehandlet for variantkalling og merknader av GATK Haplotype Caller og ANNOVAR. Funksjonell prediksjon og annotering av alle potensielle kandidater vil deretter bli utført av dbNSFP inkludert 29 algoritmer, 9 bevaringsskårer og relatert informasjon observert i mange populasjonsdatabaser som 1000 Genomes, ExAC, gnomAD og NHLBI Exome sekvenseringsprosjektet ESP6500 Variantprioritering. mistenkte etiologiske varianter filtrert av et målrettet epilepsipanel på 671 gener vil bli grundig analysert i henhold til 2015-anbefalingene fra American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Sanger-sekvensering vil også bli brukt til å validere familiesegregeringen av alle påviste kandidatvarianter, som anbefalt. Variantene er klassifisert i fem kategorier: 1) godartet, 2) sannsynlig godartet, 3) usikkert betydning, 4) sannsynlig sykdomsfremkallende og 5) patogent. Variantene med mindre allelfrekvenser >0,05 i noen av disse databasene: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC og NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) vil bli filtrert ut. Analysene som utføres vil inkludere beregningsanalyse av DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Functional Analysis through Hidden Markov Models-MKL-koding, Combined annotation-dependent depletion, og EIGEN score.

De massive sekvensdataene, begrensede kjente sykdomsmekanismer og genetisk heterogenitet bidrar til kompleksiteten til mange tilstander, for eksempel DEEs. Dermed vil avgjørende varianttolkning bli utført i tverrfaglige diskusjoner blant genetikere, klinikere, laboratorieteknikere og biostatistikere under vanlige formelle genombord-sesjoner (GB) gjennom hele studieperioden.

GB-er er tverrfaglige sesjoner arrangert av HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), hvor filer med pasienter som så langt unngikk diagnosen blir gjennomgått. Pediatrisk nevrologi GBs setter sammen nevro pediater, pediatriske radiologer, klinisk genetikere, biologer og bioinformatikere fra divisjonen Genetisk medisin, samt andre spesialister som sakene etterspør, f.eks. voksne nevrologer, laboratoriemedisinspesialister, immunologer eller andre spesialister. Sammen gjennomgår de pasientens genetiske varianter i gener som kan forklare sykdommen, og enten avviser de eller foreslår å bestille ytterligere, ekstremt fokuserte undersøkelser for a posteriori validering av fenotypen. Hvis ingen diagnose kan nås, inviteres pasienten til å komme tilbake til klinikken for en ny GB 18-24 måneder senere. Vår interne serie viser at, siden de ble implementert i februar 2019, har GBs tillatt HUG å øke diagnostikkfrekvensen på DEE fra omtrent 45 % til 55 %. GBs finner sted i et videokonferanserom utstyrt for sikker og konfidensiell utveksling av pasientdata under medisinsk hemmelighold over lange avstander. Genetiske data om pasientene blir diskutert, men ikke kopiert eller overført fra et senter til et annet. Data består av en liste over genetiske varianter i forskjellige gener av det målrettede WES, med merknader fra offentlige og interne databaser (f.eks. GnomAD) sammen med beregninger fra bioinformatikkverktøy (f.eks. CADD-score). Vanligvis vil nevrobarnelegen presentere de kliniske dataene til pasienten, den pediatriske radiologen vil vise og kommentere MR, genetikeren vil presentere de klinisk relevante genene som bærer kandidatvarianter, og laboratorieteamet for molekylærdiagnostikk av biologer og bioinformatikere vil kvalifisere seg. variantene som patogene, sannsynlig patogene eller av ukjent betydning. I sistnevnte tilfelle vil teamet gjennomgå litteraturen, under GB, for å avgjøre om en ekstra test definitivt kan bekrefte en antatt diagnose, dvs. bekrefte fenotypen forårsaket av genet som bærer en variant så langt kvalifisert som av ukjent betydning.

Vi har ekspertise på neste generasjons sekvenseringstilnærminger for å støtte klinisk diagnostikk av genetiske sykdommer siden 2012 og leverer bioinformatikkplattformer og annen translasjonell SNP-screening basert på genomomfattende assosiasjonsstudier. Teamet er sterkt interessert i å bidra med en vietnamesisk database med sjeldne sykdommer.