Investigaciones genéticas en niños con encefalopatías epilépticas y del desarrollo en la ciudad de Ho Chi Minh, Vietnam

Con este estudio de cohorte prospectivo, deseamos conocer la proporción de niños con encefalopatías epilépticas y del desarrollo seguidos en el centro de neurología pediátrica más grande de Vietnam del Sur y matriculados consecutivamente para quienes las investigaciones genéticas avanzadas permiten la identificación de variantes genéticas patogénicas. Esperamos que esta proporción sea del 50%.

También investigaremos la proporción de niños en los que los resultados genéticos permitirán adaptaciones de tratamiento individualizadas y cambios de manejo global. Esperamos que esta proporción sea al menos del 10 %.

Este proyecto colaborativo es el primer paso para demostrar la utilidad clínica de los procedimientos genéticos de alto rendimiento para todos los pacientes con epilepsia grave de inicio temprano y dificultades de desarrollo en Vietnam. Los análisis paralelos de las secuencias del exoma de los pacientes en Vietnam y Suiza permitirán la optimización del procedimiento.

Selección de pacientes:

Basado en una tasa de natalidad de 16.745 niños/1000 personas en Vietnam (estadísticas de 2018, data.worldbank.org, consultado el 18 de diciembre de 2020), una tasa de mortalidad de 15,9/1.000 nacidos vivos en Vietnam (estadísticas de 2019, data.worldbank.org, consultado el 18 de diciembre de 2020), un total de 1'394'401 nacidos vivos en todo el país, y una población a nivel nacional de 97'752'966 de los cuales 8'602'317 viven en HCMC (estadísticas 2020, worldometers.info, revisión de la población mundial.org, consultado el 18 de diciembre de 2020), estimamos que cada año nacen en la ciudad de 122'708 a 144'046 niños, de los cuales sobreviven de 120'756 a 141'756. Sobre la base de una incidencia general calculada recientemente de 54/100.000 nacidos vivos en el estado de Victoria, Australia, y una incidencia ajustada por edad comparable de 44,8/100.000 personas en Ba Vi, un distrito rural de Vietnam, Estimar que 54-75 niños con SEI nacen cada año en HCMC. Dado que la mayoría de estos niños son seguidos en el ND2, y que muchos pacientes con enfermedades neurológicas graves provenientes de un área más amplia también consultan en el ND2, nuestro objetivo es inscribir a 50 niños por año.

Criterios de inclusión: A los pacientes consecutivos, tratados en el Hospital ND2 durante el período del estudio, se les pedirá que participen en el estudio y se les pedirá que firmen un formulario de consentimiento si cumplen todos los siguientes criterios de inclusión:

1. Epilepsia farmacorresistente, ya sea desde el inicio o en el seguimiento (según criterios ILAE 2010)
2. Retraso o regresión grave del desarrollo, según la evaluación del neurólogo pediátrico (o cociente de desarrollo <50, si se evalúa formalmente)
3. Edad de inicio de los síntomas principales (Convulsiones, Retraso en el desarrollo): 0-36 meses
4. Acuerdo para participar en el estudio y formulario de consentimiento firmado Todos los pacientes preseleccionados serán discutidos en teleconferencias mensuales entre el hospital Nhi Dong 2 y los hospitales de la Universidad de Ginebra antes de que se tomen muestras de sangre. Se tomarán muestras de sangre de los pacientes y de sus dos padres, cuando estén disponibles.

Criterios de exclusión: No se invitará a participar en el estudio a pacientes con causas estructurales, infecciosas o inflamatorias identificadas (como encefalopatía hipóxico-isquémica perinatal, trastornos cerebrovasculares, secuelas de trauma o encefalitis, trastornos neurocutáneos, etc.).

Investigaciones genéticas:

Con base en lo anterior, pretendemos comenzar nuestras investigaciones genéticas por secuenciación completa del exoma (WES), y mantener el cariotipo y el CGH-array para los casos en los que no se encuentre una variante causal. WES es un procedimiento de varios pasos que incluye la extracción de ADN, la secuenciación, el procesamiento y el mapeo del exoma, la llamada de variantes, la anotación y la priorización, como se describe a continuación. En caso de resultados WES negativos, la utilidad de realizar más pruebas se evaluará en las sesiones planificadas de la Junta del Genoma (GB).

Extracción de ADN genómico y secuenciación del exoma En resumen, para cada participante y sus padres, se tomarán muestras de 2-5 ml de sangre completa y se almacenarán en tubos recubiertos con anticoagulantes K2/K3-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). El ADN genómico se extraerá utilizando un kit de aislamiento de sangre de ADN Mini (QIAGEN DmbH, Países Bajos). La cantidad de ADN se medirá con el kit de ensayo Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA (Invitrogen), un método ultrasensible de tinción de ácido nucleico fluorescente para cuantificar el ADN de doble cadena, utilizando la fluorometría Victor 3, y la condición del ADN se evaluará con gel al 1 %. electroforesis para asegurar la calidad y cantidad de muestras de ADN antes del paso de secuenciación.

La secuenciación completa del exoma se dirige a todas las regiones codificantes de proteínas y representa el 85 % de las mutaciones altamente penetrantes en el genoma humano. La secuenciación del exoma completo se realizará en un laboratorio certificado por CLIA en Macrogen Ltd., Seúl, Corea. Las bibliotecas construidas se secuenciarán utilizando el kit de captura de exoma Agilent SureSelect V5 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.), que utiliza cebos de ARNc biotinilado de 120 mer para capturar y enriquecer las regiones del exoma (357 999 exones en total), en un NovaSeq Sistema de secuenciación 6000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.).

Las secuencias de ADN obtenidas por WES (archivos FASTQ) se analizarán "in silico" en paralelo, pero enmascaradas entre sí, en Ciudad Ho Chi Minh y en Ginebra, al igual que las decisiones para análisis adicionales enfocados basados ​​en la descripción fenotípica (p. ej., Secuenciación de Sanger de algunos exones pobremente cubiertos en genes específicos). Con ese fin, se transferirán a Ginebra partes alícuotas codificadas de ADN de pacientes y padres.

Procesamiento y mapeo de datos sin procesar Los datos sin procesar se analizarán en la ciudad de Ho Chi Minh mediante un proceso interno de bioinformática y de forma independiente en Ginebra. La calidad de los datos sin procesar de FASTQ se garantizará mediante la asignación de Phred-score, el contenido de GC, la longitud de lectura, la calidad de lectura y el nivel de duplicación de secuencias. Se aplicará el paso de preprocesamiento con Trimmomatic para eliminar las lecturas de baja calidad y las secuencias contaminantes del adaptador. Los algoritmos de BWA-MEM, PICARD y GATK se utilizarán para el mapeo y el procesamiento posterior a la alineación, incluida la eliminación de duplicados y la recalibración de la calidad base para marcar o eliminar cualquier artefacto.

Llamada y anotación de variantes Los datos de mapeo refinados serán luego procesados ​​para la llamada y anotación de variantes por GATK Haplotype Caller y ANNOVAR. La predicción funcional y la anotación de todos los candidatos potenciales serán realizadas por dbNSFP, incluidos 29 algoritmos, 9 puntajes de conservación e información relacionada observada en muchas bases de datos de población, como 1000 Genomes, ExAC, gnomAD y el proyecto de secuenciación de exomas del NHLBI ESP6500. Priorización de variantes. Las variantes etiológicas sospechosas filtradas por un panel de epilepsia específico de 671 genes se analizarán a fondo de acuerdo con las recomendaciones de 2015 del Colegio Estadounidense de Genética Médica y Genómica (ACMG). La secuenciación de Sanger también se utilizará para validar la segregación familiar de todas las variantes candidatas detectadas, como se recomienda. Las variantes se clasifican en cinco categorías: 1) benignas, 2) probablemente benignas, 3) de significado incierto, 4) probablemente patogénicas y 5) patogénicas. Se filtrarán las variantes con frecuencias alélicas menores >0,05 en cualquiera de estas bases de datos: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC y NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500). Los análisis realizados incluirán el análisis computacional de DANN, el perfil de tasa evolutiva genómica ++, la prueba de relación de probabilidad, el probador de mutaciones, el análisis funcional a través de la codificación MKL de modelos ocultos de Markov, el agotamiento dependiente de la anotación combinada y la puntuación EIGEN.

Los datos de secuencia masiva, los mecanismos de enfermedad conocidos limitados y la heterogeneidad genética contribuyen a la complejidad de muchas condiciones, como las EDE. Por lo tanto, la interpretación variante concluyente se llevará a cabo en debates multidisciplinarios entre genetistas, clínicos, técnicos de laboratorio y bioestadísticos durante las sesiones formales regulares de la junta de genoma (GB), durante todo el período de estudio.

Las GB son sesiones multidisciplinares organizadas por el Centro de Medicina Genómica HUG (CGEM), donde se revisan expedientes de pacientes que hasta ahora eludían el diagnóstico. Los GB de neurología pediátrica reúnen a neuropediatras, radiólogos pediátricos, genetistas clínicos, biólogos y bioinformáticos de la división de Medicina Genética, así como otros especialistas según lo soliciten los casos, p. neurólogos de adultos, especialistas en medicina de laboratorio, inmunólogos u otros especialistas. Juntos, revisan las variantes genéticas del paciente en genes que podrían explicar la enfermedad, y las rechazan o proponen ordenar investigaciones adicionales extremadamente enfocadas para la validación a posteriori del fenotipo. Si no se puede llegar a un diagnóstico, se invita al paciente a regresar a la clínica para un nuevo GB 18-24 meses después. Nuestra serie interna muestra que, desde que se implementaron en febrero de 2019, los GB han permitido que HUG aumente su tasa de diagnóstico de DEE de aproximadamente un 45 % a un 55 %. Las GB tienen lugar en una sala de videoconferencia equipada para el intercambio seguro y confidencial de datos de pacientes bajo secreto médico a largas distancias. Los datos genéticos de los pacientes se discuten pero no se copian ni se transfieren de un centro a otro. Los datos consisten en una lista de variantes genéticas en diferentes genes del WES objetivo, con anotaciones de bases de datos públicas e internas (p. ej., GnomAD) junto con cálculos de herramientas bioinformáticas (p. ej., puntaje CADD). Por lo general, el neuropediatra presentará los datos clínicos del paciente, el radiólogo pediátrico mostrará y comentará la resonancia magnética, el genetista presentará los genes clínicamente relevantes que portan variantes candidatas y el equipo de biólogos y bioinformáticos del laboratorio de diagnóstico molecular calificará las variantes como patógenas, probablemente patógenas o de significado desconocido. En este último caso, el equipo revisará la literatura, durante el GB, para decidir si una prueba adicional podría confirmar definitivamente un diagnóstico putativo, es decir, confirmar el fenotipo causado por el gen portador de una variante hasta ahora calificada como de significado desconocido.

Tenemos experiencia en enfoques de secuenciación de próxima generación para respaldar el diagnóstico clínico de enfermedades genéticas desde 2012 y suministra plataformas bioinformáticas y otras pruebas de detección de SNP traslacionales basadas en estudios de asociación de todo el genoma. El equipo está muy interesado en contribuir con la base de datos de enfermedades raras genómicas vietnamitas.