Genetische Untersuchungen bei Kindern mit Entwicklungs- und epileptischen Enzephalopathien in Ho-Chi-Minh-Stadt, Vietnam

Mit dieser prospektiven Kohortenstudie möchten wir den Anteil der Kinder mit entwicklungsbedingten und epileptischen Enzephalopathien kennen, die in der größten pädiatrischen neurologischen Einrichtung in Südvietnam beobachtet und nacheinander eingeschrieben wurden, für die fortgeschrittene genetische Untersuchungen die Identifizierung pathogener Genvarianten ermöglichen. Wir rechnen mit einem Anteil von 50 %.

Wir werden auch den Anteil der Kinder untersuchen, bei denen die genetischen Ergebnisse individuelle Behandlungsanpassungen und globale Managementänderungen ermöglichen. Wir rechnen mit einem Anteil von mindestens 10 %.

Dieses Verbundprojekt ist der erste Schritt, um den klinischen Nutzen genetischer Hochdurchsatzverfahren für alle Patienten mit schwerer früh einsetzender Epilepsie und Entwicklungsschwierigkeiten in Vietnam zu demonstrieren. Parallele Analysen von Exomsequenzen von Patienten in Vietnam und der Schweiz ermöglichen die Optimierung des Verfahrens.

Patientenauswahl:

Basierend auf einer Geburtenrate von 16.745 Kindern/1000 Menschen in Vietnam (Statistiken von 2018, data.worldbank.org, konsultiert am 18.12.2020), eine Sterblichkeitsrate von 15,9/1'000 Lebendgeburten in Vietnam (Statistiken 2019, data.worldbank.org, konsultiert am 18. Dezember 2020), insgesamt 1'394'401 Lebendgeburten im ganzen Land und eine landesweite Bevölkerung von 97'752'966, von denen 8'602'317 in HCMC leben (Statistiken 2020, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsultiert am 18.12.2020) schätzen wir, dass in der Stadt jedes Jahr 122'708 bis 144'046 Kinder geboren werden, wovon 120'756 bis 141'756 am Leben bleiben werden. Auf der Grundlage einer kürzlich berechneten allgemeinen Inzidenz von 54/100'000 Lebendgeburten im Bundesstaat Victoria, Australien, und einer vergleichbaren altersbereinigten Inzidenz von 44,8/100'000 Personen in Ba Vi, einem ländlichen Distrikt in Vietnam, haben wir schätzen, dass jedes Jahr 54-75 Kinder mit SEI in HCMC geboren werden. Angesichts der Tatsache, dass die Mehrheit dieser Kinder bei ND2 betreut wird und viele Patienten mit schweren neurologischen Erkrankungen aus einem breiteren Gebiet ebenfalls bei ND2 konsultiert werden, ist es unser Ziel, 50 Kinder pro Jahr einzuschreiben.

Einschlusskriterien: Konsekutivpatienten, die während des Studienzeitraums im ND2-Krankenhaus behandelt werden, werden gebeten, an der Studie teilzunehmen und werden aufgefordert, eine Einverständniserklärung zu unterzeichnen, wenn sie alle der folgenden Einschlusskriterien erfüllen:

1. Arzneimittelresistente Epilepsie, entweder von Anfang an oder bei der Nachsorge (gemäß den Kriterien von ILAE 2010)
2. Schwerwiegende Entwicklungsverzögerung oder -regression gemäß Beurteilung durch einen Kinderneurologen (oder Entwicklungsquotient <50, falls formal beurteilt)
3. Alter des Auftretens der Hauptsymptome (Anfälle, Entwicklungsverzögerung): 0-36 Monate
4. Zustimmung zur Teilnahme an der Studie und unterschriebene Einverständniserklärung Alle vorausgewählten Patienten werden vor der Blutentnahme in monatlichen Telefonkonferenzen zwischen dem Krankenhaus Nhi Dong 2 und den Universitätsspitälern Genf besprochen. Sofern verfügbar, werden den Patienten und ihren beiden Elternteilen Blutproben entnommen.

Ausschlusskriterien: Patienten mit identifizierten strukturellen, infektiösen oder entzündlichen Ursachen (wie z. B. perinatale hypoxisch-ischämische Enzephalopathie, zerebrovaskuläre Erkrankungen, Folgen eines Traumas oder einer Enzephalitis, neurokutane Erkrankungen usw.) werden nicht zur Teilnahme an der Studie aufgefordert.

Genetische Untersuchungen:

Basierend auf dem Vorhergehenden beabsichtigen wir, unsere genetischen Untersuchungen mit Whole Exome Sequencing (WES) zu beginnen und Karyotypisierung und CGH-Array für Fälle beizubehalten, in denen keine kausale Variante gefunden wird. WES ist ein mehrstufiges Verfahren, das DNA-Extraktion, Exomsequenzierung, Verarbeitung und Kartierung, Varianten-Calling, Annotation und Priorisierung umfasst, wie unten beschrieben. Im Falle negativer WES-Ergebnisse wird die Nützlichkeit weiterer Tests in den geplanten Sitzungen des Genome Board (GB) evaluiert.

Genomische DNA-Extraktion und Exomsequenzierung Kurz gesagt werden für jeden Teilnehmer und seine/ihre Eltern 2–5 ml Vollblut entnommen und in mit K2/K3-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Antikoagulantien beschichteten Röhrchen aufbewahrt. Genomische DNA wird mit einem DNA Mini Blood Isolation Kit (QIAGEN DmbH, Niederlande) extrahiert. Die DNA-Menge wird mit dem Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen) gemessen, einer hochempfindlichen fluoreszierenden Nukleinsäure-Färbemethode zur Quantifizierung doppelsträngiger DNA unter Verwendung von Victor 3-Fluorometrie, und der Zustand der DNA wird mit einem 1%igen Gel bewertet Elektrophorese, um die Qualität und Quantität der DNA-Proben vor dem Sequenzierungsschritt sicherzustellen.

Whole Exome Sequencing zielt auf alle proteinkodierenden Regionen ab und ist für 85 % der hochgradig penetranten Mutationen im menschlichen Genom verantwortlich. Die Sequenzierung des gesamten Exoms wird in einem CLIA-zertifizierten Labor bei Macrogen Ltd., Seoul, Korea, durchgeführt. Die konstruierten Bibliotheken werden mit dem Agilent SureSelect V5 Exome Capture Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornien, USA) sequenziert, das 120-mer biotinylierte cRNA-Köder verwendet, um Exomregionen (insgesamt 357.999 Exons) auf einem NovaSeq zu erfassen und anzureichern 6000-Sequenzierungssystem (Illumina, San Diego, CA, USA).

Durch WES gewonnene DNA-Sequenzen (FASTQ-Files) werden parallel, aber zueinander verblindet, in Ho-Chi-Minh-Stadt und in Genf „in silico“ analysiert, ebenso wie Entscheidungen für zusätzliche, fokussierte Analysen auf der Grundlage der phänotypischen Beschreibung (z. Sanger-Sequenzierung einiger schlecht abgedeckter Exons in bestimmten Genen). Zu diesem Zweck werden kodierte Aliquots von Patienten- und Eltern-DNAs nach Genf überführt.

Rohdatenverarbeitung und Kartierung Die Rohdaten werden in Ho-Chi-Minh-Stadt mithilfe einer hauseigenen Bioinformatik-Pipeline und unabhängig davon in Genf analysiert. Die Qualität der FASTQ-Rohdaten wird durch die Phred-Score-Zuweisung, den GC-Inhalt, die Leselänge, die Lesequalität und den Grad der Sequenzduplizierung sichergestellt. Der Vorverarbeitungsschritt mit Trimmomatic wird angewendet, um alle minderwertigen Reads und kontaminierenden Adaptersequenzen zu entfernen. Die Algorithmen von BWA-MEM, PICARD und GATK werden für die Kartierung und zusätzliche Post-Alignment-Verarbeitung verwendet, einschließlich der Entfernung von Duplikaten und der Neukalibrierung in Basisqualität, um Artefakte zu markieren oder zu entfernen.

Varianten-Calling und Annotation Die verfeinerten Kartierungsdaten werden dann für das Varianten-Calling und die Annotation durch GATK Haplotype Caller und ANNOVAR weiterverarbeitet. Die funktionale Vorhersage und Annotation aller potenziellen Kandidaten wird dann von dbNSFP durchgeführt, einschließlich 29 Algorithmen, 9 Erhaltungsbewertungen und verwandter Informationen, die in vielen Populationsdatenbanken wie 1000 Genomes, ExAC, gnomAD und dem NHLBI Exome Sequencing Project ESP6500 Variant Prioritization The beobachtet werden Verdächtige ätiologische Varianten, die durch ein gezieltes Epilepsie-Panel aus 671 Genen gefiltert werden, werden gemäß den Empfehlungen des American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) von 2015 gründlich analysiert. Die Sanger-Sequenzierung wird auch verwendet, um die Familientrennung aller erkannten Kandidatenvarianten wie empfohlen zu validieren. Die Varianten werden in fünf Kategorien eingeteilt: 1) gutartig, 2) wahrscheinlich gutartig, 3) unsichere Bedeutung, 4) wahrscheinlich pathogen und 5) pathogen. Die Varianten mit Nebenallelhäufigkeiten >0,05 in einer dieser Datenbanken: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC und NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) werden herausgefiltert. Die durchgeführten Analysen umfassen Computeranalysen von DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Funktionsanalyse durch Hidden-Markov-Modelle-MKL-Codierung, kombinierte annotationsabhängige Erschöpfung und EIGEN-Score.

Die massiven Sequenzdaten, die begrenzt bekannten Krankheitsmechanismen und die genetische Heterogenität tragen zur Komplexität vieler Erkrankungen wie DEEs bei. Daher wird während des gesamten Studienzeitraums eine schlüssige Varianteninterpretation in multidisziplinären Diskussionen zwischen Genetikern, Klinikern, Labortechnikern und Biostatistikern während regelmäßiger Sitzungen des formellen Genomausschusses (GB) durchgeführt.

GBs sind multidisziplinäre Sitzungen, die vom HUG Center of Genomic Medicine (CGEM) veranstaltet werden und bei denen Akten von Patienten überprüft werden, die sich bisher einer Diagnose entzogen haben. Neuropädiatrische GBs stellen Neuropädiater, Kinderradiologen, Klinische Genetiker, Biologen und Bioinformatiker des Fachbereichs Genetische Medizin sowie fallbezogen weitere Spezialisten zusammen, z.B. Erwachsene Neurologen, Labormediziner, Immunologen oder andere Spezialisten. Gemeinsam überprüfen sie die genetischen Varianten des Patienten in Genen, die die Krankheit erklären könnten, und lehnen sie entweder ab oder schlagen vor, zusätzliche, äußerst fokussierte Untersuchungen zur nachträglichen Validierung des Phänotyps anzuordnen. Wenn keine Diagnose gestellt werden kann, wird der Patient eingeladen, 18-24 Monate später für einen neuen GB in die Klinik zurückzukehren. Unsere interne Serie zeigt, dass GBs es dem HUG seit seiner Implementierung im Februar 2019 ermöglicht haben, seine Diagnoserate von DEE von etwa 45 % auf 55 % zu steigern. GBs finden in einem Videokonferenzraum statt, der für den sicheren und vertraulichen Austausch von Patientendaten unter ärztlicher Schweigepflicht über große Entfernungen ausgestattet ist. Genetische Daten der Patienten werden besprochen, aber nicht kopiert oder von einem Zentrum zum anderen übertragen. Die Daten bestehen aus einer Liste genetischer Varianten in verschiedenen Genen des Ziel-WES mit Anmerkungen aus öffentlichen und internen Datenbanken (z. B. GnomAD) sowie Berechnungen aus Bioinformatik-Tools (z. B. CADD-Score). Typischerweise präsentiert der Neuropädiater die klinischen Daten des Patienten, der Kinderradiologe zeigt und kommentiert das MRT, der Genetiker präsentiert die klinisch relevanten Gene, die Kandidatenvarianten tragen, und das molekulardiagnostische Laborteam aus Biologen und Bioinformatikern qualifiziert die Varianten als pathogen, wahrscheinlich pathogen oder von unbekannter Bedeutung. Im letzteren Fall wird das Team während des GB die Literatur überprüfen, um zu entscheiden, ob ein zusätzlicher Test eine mutmaßliche Diagnose definitiv bestätigen könnte, d. h. den Phänotyp bestätigen, der durch das Gen verursacht wird, das eine Variante trägt, die bisher als von unbekannter Bedeutung eingestuft wurde.

Wir verfügen seit 2012 über Expertise in Next-Generation-Sequencing-Ansätzen zur Unterstützung der klinischen Diagnose genetischer Erkrankungen und bieten Bioinformatik-Plattformen und andere translationale SNP-Screenings auf der Grundlage genomweiter Assoziationsstudien. Das Team ist stark daran interessiert, einen Beitrag zur vietnamesischen Datenbank für seltene Krankheiten zu leisten.