베트남 호치민시의 발달 및 간질성 뇌병증 아동의 유전적 조사

이 전향적 코호트 연구를 통해 발달 및 간질성 뇌병증이 있는 아동의 비율을 알고자 합니다. 남베트남에서 가장 큰 소아 신경과 시설에서 연속적으로 등록한 아동의 고급 유전 조사를 통해 병원성 유전자 변이를 식별할 수 있습니다. 이 비율은 50%가 될 것으로 예상합니다.

우리는 또한 유전적 결과가 개별화된 치료 적응 및 전반적인 관리 변화를 허용할 어린이의 비율을 조사할 것입니다. 이 비율은 최소 10%가 될 것으로 예상합니다.

이 공동 프로젝트는 베트남에서 중증 조기 발병 간질 및 발달 장애가 있는 모든 환자를 위한 고처리량 유전자 절차의 임상적 유용성을 입증하기 위한 첫 번째 단계입니다. 베트남과 스위스에서 환자의 엑솜 서열에 대한 병렬 분석을 통해 절차를 최적화할 수 있습니다.

환자 선택:

베트남의 출생률 16.745명/1000명 기준(2018년 통계, data.worldbank.org, 2020년 12월 18일 참조), 베트남의 사망률은 15.9/1,000명입니다(2019년 통계, data.worldbank.org, 2020년 12월 18일 참조), 전국에서 총 1'394'401명의 출생, 전국 인구 97'752'966명 중 8'602'317명이 HCMC에 거주합니다(2020 통계, worldometers.info, worldpopulationreview.org, 2020년 12월 18일 참조), 우리는 매년 122'708에서 144'046명의 아이들이 이 도시에서 태어나고 그 중 120'756에서 141'756명이 살아남을 것으로 추정합니다. 호주 빅토리아 주에서 최근에 계산된 54/100,000의 일반 발생률과 베트남 농촌 지역인 Ba Vi에서 44.8/100,000의 유사한 연령 조정 발생률을 기반으로, 우리는 매년 54-75명의 SEI 어린이가 호치민에서 태어난다고 추정합니다. 이 아이들의 대다수가 ND2에서 추적되고 있고 더 넓은 지역에서 오는 심각한 신경학적 상태를 가진 많은 환자들도 ND2에서 상담한다는 사실을 감안할 때, 우리의 목표는 연간 50명의 아이들을 등록하는 것입니다.

포함 기준: 연구 기간 동안 ND2 병원에서 치료를 받은 연속 환자는 연구 참여를 요청받게 되며 다음 포함 기준을 모두 충족하는 경우 동의서에 서명하도록 요청됩니다.

1. 약물 내성 간질, 발병 시점부터 또는 후속 조치 시점(ILAE 2010 기준에 따름)
2. 소아 신경과 전문의의 평가에 따른 심각한 발달 지연 또는 퇴행(또는 공식적으로 평가된 경우 발달 지수 <50)
3. 주요 증상(발작, 발달 지연)이 시작되는 연령: 0-36개월
4. 연구 참여에 대한 동의 및 서명된 동의서 미리 선택된 모든 환자는 혈액 샘플을 채취하기 전에 Nhi Dong 2 병원과 Geneva University 병원 간의 월간 원격 회의에서 논의될 것입니다. 가능한 경우 환자와 양쪽 부모로부터 혈액 샘플을 채취합니다.

제외 기준: 확인된 구조적, 감염성 또는 염증성 원인(예: 주산기 저산소성 허혈성 뇌병증, 뇌혈관 장애, 외상 또는 뇌염의 후유증, 신경피부 장애 등)이 있는 환자는 연구에 참여하도록 요청받지 않습니다.

유전자 조사:

앞선 내용을 바탕으로 WES(Whole Exome Sequencing)로 유전자 조사를 시작하고 인과적 변이가 발견되지 않은 경우에 대해 핵형 분석 및 CGH-배열을 유지할 계획입니다. WES는 아래에 설명된 대로 DNA 추출, 엑솜 시퀀싱, 처리 및 매핑, 변형 호출, 주석 및 우선 순위 지정을 포함하는 다단계 절차입니다. WES 결과가 음성인 경우 계획된 게놈 보드(GB) 세션에서 추가 테스트 수행의 유용성을 평가합니다.

게놈 DNA 추출 및 엑솜 시퀀싱 간단히 말해서, 각 참가자와 그/그녀의 부모 모두에 대해 2-5ml의 전혈을 샘플링하여 K2/K3-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 항응고제로 코팅된 튜브에 보관합니다. 게놈 DNA는 DNA Mini Blood Isolation 키트(QIAGEN DmbH, 네덜란드)를 사용하여 추출됩니다. DNA 양은 Victor 3 fluorometry를 사용하여 double-stranded DNA 정량을 위한 초고감도 형광 핵산 염색 방법인 Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit(Invitrogen)로 측정되며, DNA 상태는 1% 젤로 평가됩니다. 시퀀싱 단계 전에 DNA 샘플의 품질과 양을 보장하기 위한 전기영동.

Whole Exome Sequencing은 모든 단백질 코딩 영역을 대상으로 하며 인간 게놈에서 침투성이 높은 돌연변이의 85%를 차지합니다. Whole Exome Sequencing은 한국 서울에 있는 Macrogen Ltd.의 CLIA 인증 실험실에서 수행됩니다. 구성된 라이브러리는 Agilent SureSelect V5 엑솜 포획 키트(Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)를 사용하여 시퀀싱됩니다. 이 키트는 120-mer biotinylated cRNA 미끼를 사용하여 NovaSeq에서 엑솜 영역(총 357,999 엑손)을 포획하고 강화합니다. 6000 시퀀싱 시스템(Illumina, San Diego, CA, USA).

WES(FASTQ 파일)에서 얻은 DNA 서열은 표현형 설명(예: 특정 유전자에서 제대로 커버되지 않은 일부 엑손의 Sanger 시퀀싱). 이를 위해 환자와 부모 DNA의 암호화된 부분표본이 제네바로 전송될 것입니다.

원시 데이터 처리 및 매핑 원시 데이터는 자체 생물 정보학 파이프라인을 사용하여 호치민 시에서, 그리고 제네바에서 독립적으로 분석됩니다. FASTQ 원시 데이터의 품질은 Phred-score 할당, GC 콘텐츠, 읽기 길이, 읽기 품질 및 시퀀스 복제 수준에 의해 보장됩니다. Trimmomatic을 사용하는 전처리 단계는 낮은 품질의 판독 및 어댑터 오염 시퀀스를 제거하기 위해 적용됩니다. BWA-MEM, PICARD 및 GATK의 알고리즘은 중복 제거 및 아티팩트를 표시하거나 제거하기 위한 기본 품질 재보정을 포함하여 매핑 및 추가 사후 정렬 처리에 사용됩니다.

변형 호출 및 주석 정제된 매핑 데이터는 GATK Haplotype Caller 및 ANNOVAR에 의한 변형 호출 및 주석을 위해 추가로 처리됩니다. 모든 잠재적 후보의 기능적 예측 및 주석은 29개의 알고리즘, 9개의 보존 점수 및 1000 Genomes, ExAC, gnomAD 및 NHLBI Exome 시퀀싱 프로젝트 ESP6500 변형 우선순위 지정과 같은 많은 인구 데이터베이스에서 관찰된 관련 정보를 포함하여 dbNSFP에 의해 수행됩니다. 671개 유전자의 표적 간질 패널에 의해 필터링된 의심되는 병인 변이체는 American College of Medical Genetics and Genomics(ACMG)의 2015년 권장 사항에 따라 철저히 분석됩니다. 또한 Sanger 시퀀싱은 권장된 대로 감지된 모든 후보 변이체의 패밀리 분리를 검증하는 데 사용됩니다. 변이는 1) 양성, 2) 가능성이 있는 양성, 3) 불확실한 의미, 4) 가능성이 있는 병원성 및 5) 병원성의 5가지 범주로 분류됩니다. dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC 및 NHLBI Exome Sequencing Project(ESP6500) 데이터베이스에서 부 대립유전자 빈도 >0.05를 갖는 변이체는 필터링됩니다. 수행된 분석에는 DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutation Taster, Hidden Markov Models-MKL 코딩을 통한 기능 분석, Combined annotation-dependent depletion 및 EIGEN 점수의 전산 분석이 포함됩니다.

방대한 서열 데이터, 제한된 알려진 질병 메커니즘 및 유전적 이질성은 DEE와 같은 많은 조건의 복잡성에 기여합니다. 따라서 결정적인 변형 해석은 연구 기간 동안 정규 공식 게놈 보드(GB) 세션에서 유전학자, 임상의, 실험실 기술자 및 생물통계학자 간의 다학제적 토론에서 수행될 것입니다.

GB는 지금까지 진단을 피한 환자의 파일을 검토하는 HUG 유전체 의학 센터(CGEM)에서 주최하는 종합 세션입니다. 소아 신경과 GB는 유전 의학 부서의 신경 소아과 의사, 소아 방사선과 의사, 임상 유전학자, 생물 학자 및 생물 정보학자뿐만 아니라 사례에서 요청한 다른 전문가를 모았습니다. 성인 신경학자, 검사실 의학 전문가, 면역학자 또는 기타 전문가. 함께, 그들은 질병을 설명할 수 있는 유전자에서 환자의 유전적 변이를 검토하고, 이를 거부하거나 표현형의 사후 검증을 위해 극도로 집중된 추가 조사를 주문할 것을 제안합니다. 진단에 도달할 수 없는 경우 환자는 18-24개월 후 새로운 GB를 위해 클리닉으로 다시 오도록 초대됩니다. 당사의 사내 시리즈에 따르면 GB는 2019년 2월에 구현된 이후로 HUG가 DEE의 진단률을 약 45%에서 55%로 높일 수 있도록 했습니다. GB는 의료비밀로 장거리에서 환자 데이터를 안전하고 기밀로 교환할 수 있는 화상회의실에서 진행됩니다. 환자의 유전 데이터는 논의되지만 한 센터에서 다른 센터로 복사되거나 전송되지 않습니다. 데이터는 생물 정보학 도구(예: CADD 점수)의 계산과 함께 공개 및 사내 데이터베이스(예: GnomAD)의 주석과 함께 표적 WES의 여러 유전자에 있는 유전 변이 목록으로 구성됩니다. 일반적으로 신경 소아과 의사는 환자의 임상 데이터를 제시하고, 소아 방사선과 의사는 MRI를 보여주고 의견을 제시하고, 유전학자는 후보 변이를 포함하는 임상 관련 유전자를 제시하고, 생물학자와 생물정보학자로 구성된 분자 진단 실험실 팀이 자격을 갖추게 됩니다. 변종은 병원성, 병원성 가능성이 있거나 중요성을 알 수 없습니다. 후자의 경우 팀은 GB 동안 문헌을 검토하여 추가 테스트가 추정 진단을 확실히 확인할 수 있는지, 즉 지금까지 알려지지 않은 중요성으로 자격을 갖춘 변이를 운반하는 유전자로 인한 표현형을 확인하는지 결정합니다.

2012년부터 유전 질환의 임상 진단을 지원하기 위한 차세대 시퀀싱 접근법에 대한 전문 지식을 보유하고 있으며, 게놈 차원의 연관성 연구를 기반으로 하는 생물 정보학 플랫폼 및 기타 번역 SNP 스크리닝을 공급합니다. 팀은 베트남 게놈 희귀 질환 데이터베이스에 기여하는 데 큰 관심을 가지고 있습니다.