Genetiske undersøgelser hos børn med udviklingsmæssig og epileptisk encefalopati i Ho Chi Minh City, Vietnam

Med denne prospektive kohorteundersøgelse ønsker vi at kende andelen af ​​børn med udviklingsmæssige og epileptiske encefalopatier, der følges på den største pædiatriske neurologifacilitet i Sydvietnam og indskrives fortløbende, for hvem avancerede genetiske undersøgelser tillader identifikation af patogene genvarianter. Vi forventer, at denne andel bliver 50 %.

Vi vil også undersøge andelen af ​​børn, hvor de genetiske resultater vil muliggøre individualiserede behandlingstilpasninger og globale ledelsesændringer. Vi forventer, at denne andel vil være mindst 10 %.

Dette samarbejdsprojekt er det første skridt til at demonstrere den kliniske nytte af high-throughput genetiske procedurer for alle patienter med svær tidligt opstået epilepsi og udviklingsmæssige vanskeligheder i Vietnam. Parallelle analyser af patienters exome-sekvenser i Vietnam og Schweiz vil muliggøre optimering af proceduren.

Patientvalg:

Baseret på en fødselsrate på 16.745 børn/1000 mennesker i Vietnam (2018-statistikker, data.worldbank.org, konsulteret den 18. december 2020), en dødelighed på 15,9/1.000 levendefødte i Vietnam (2019-statistikker, data.worldbank.org, konsulteret den 18. december 2020), i alt 1.394.401 levendefødte i hele landet og en landsdækkende befolkning på 97.752.966, hvoraf 8.602.317 bor i HCMC (2020-statistikker, worldometers.info, worldpopulationreview.org, konsulteret den 18. december 2020), anslår vi, at der fødes 122.708 til 144.046 børn i byen hvert år, hvoraf 120.756 til 141.756 vil forblive i live. På grundlag af en nyligt beregnet generel forekomst på 54/100.000 levendefødte i staten Victoria, Australien, og en sammenlignelig aldersjusteret forekomst på 44,8/100.000 personer i Ba Vi, et landdistrikt i Vietnam, har vi anslå, at 54-75 børn med SEI fødes hvert år i HCMC. I betragtning af, at et flertal af disse børn følges på ND2, og at mange patienter med svære neurologiske lidelser fra et bredere område også konsulterer på ND2, er vores mål at indskrive 50 børn om året.

Inklusionskriterier: Konsekutive patienter, behandlet på ND2 Hospital i løbet af undersøgelsesperioden, vil blive bedt om at deltage i undersøgelsen og vil blive bedt om at underskrive en samtykkeerklæring, hvis de opfylder alle følgende inklusionskriterier:

1. Lægemiddelresistent epilepsi, enten fra starten eller ved opfølgning (i henhold til ILAE 2010-kriterier)
2. Alvorlig udviklingsforsinkelse eller regression ifølge pædiatrisk neurologevaluering (eller udviklingskvotient <50, hvis formelt vurderes)
3. Alder for debut af hovedsymptomer (anfald, udviklingsforsinkelse): 0-36 måneder
4. Aftale om at deltage i undersøgelsen og underskrevet samtykkeerklæring Alle de forudvalgte patienter vil blive diskuteret i månedlige telekonferencer mellem Nhi Dong 2 hospitalet og Geneve University hospitalerne, før der tages blodprøver. Blodprøver vil blive taget fra patienterne og deres begge forældre, når de er tilgængelige.

Eksklusionskriterier: Patienter med identificerede strukturelle, infektiøse eller inflammatoriske årsager (såsom perinatal hypoxisk-iskæmisk encefalopati, cerebrovaskulære lidelser, følgevirkninger af traumer eller encephalitis, neurokutane lidelser osv.) vil ikke blive bedt om at deltage i undersøgelsen.

Genetiske undersøgelser:

Baseret på det, der går forud, har vi til hensigt at starte vores genetiske undersøgelser ved Whole Exome Sequencing (WES), og beholde karyotyping og CGH-array for tilfælde, hvor der ikke findes nogen kausal variant. WES er en flertrinsprocedure, der inkluderer DNA-ekstraktion, exome-sekventering, behandling og kortlægning, variantkald, annotering og prioritering som beskrevet nedenfor. I tilfælde af negative WES-resultater vil nytten af ​​at udføre yderligere tests blive evalueret i de planlagte Genome Board (GB) sessioner.

Genomisk DNA-ekstraktion og exome-sekventering Kort sagt, for hver deltager og begge hans/hendes forældre, vil 2-5 ml fuldblod blive udtaget og opbevaret i rør overtrukket med K2/K3-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) antikoagulantia. Genomisk DNA vil blive ekstraheret ved hjælp af et DNA Mini Blood Isolation kit (QIAGEN DmbH, Holland). DNA-mængden vil blive målt ved hjælp af Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kit (Invitrogen), en ultrafølsom fluorescerende nukleinsyrefarvningsmetode til kvantificering af dobbeltstrenget DNA, ved hjælp af Victor 3 fluorometri, og tilstanden af ​​DNA vil blive vurderet med 1 % gel elektroforese for at sikre kvaliteten og kvantiteten af ​​DNA-prøver før sekventeringstrinnet.

Whole Exome Sequencing retter sig mod alle proteinkodende regioner og tegner sig for 85% af stærkt penetrerende mutationer i det menneskelige genom. Whole Exome Sequencing vil blive udført i et CLIA-certificeret laboratorium hos Macrogen Ltd., Seoul, Korea. De konstruerede biblioteker vil blive sekventeret ved hjælp af Agilent SureSelect V5 exome capture kit (Agilent Technologies, Santa Clara, Californien, USA), som bruger 120-mer biotinyleret cRNA lokkemad til at fange og berige exome regioner (357.999 exoner i alt), på en NovaSeq 6000 sekventeringssystem (Illumina, San Diego, CA, USA).

DNA-sekvenser opnået af WES (FASTQ-filer) vil blive analyseret "in silico" parallelt, men blindet for hinanden, i Ho Chi Minh City og i Genève, ligesom beslutninger om yderligere, fokuserede analyser baseret på den fænotypiske beskrivelse (f.eks. Sanger-sekventering af nogle dårligt dækkede exoner i specifikke gener). Til det formål vil kodede portioner af patienter og forældre-DNA'er blive overført til Genève.

Rådatabehandling og kortlægning Rådata vil blive analyseret i Ho Chi Minh City ved hjælp af en intern bioinformatikpipeline og uafhængigt i Genève. Kvaliteten af ​​FASTQ-rådata vil blive sikret ved tildeling af Phred-score, GC-indhold, læselængde, læsekvalitet og sekvensduplikeringsniveau. Forbehandlingstrin ved hjælp af Trimmomatic vil blive anvendt til at trimme eventuelle aflæsninger af lav kvalitet og adapterkontaminantsekvenser. Algoritmerne fra BWA-MEM, PICARD og GATK vil blive brugt til kortlægning og yderligere efterjusteringsbehandling, herunder fjernelse af dubletter og genkalibrering af basiskvalitet for at markere eller fjerne eventuelle artefakter.

Variantkald og annotering De raffinerede kortlægningsdata vil derefter blive behandlet yderligere til variantkald og annotering af GATK Haplotype Caller og ANNOVAR. Funktionel forudsigelse og annotering af alle potentielle kandidater vil derefter blive udført af dbNSFP, herunder 29 algoritmer, 9 konserveringsscore og relateret information observeret i mange befolkningsdatabaser såsom 1000 Genomes, ExAC, gnomAD og NHLBI Exome sekventeringsprojektet ESP6500 Variant prioritering. Formodede ætiologiske varianter filtreret af et målrettet epilepsipanel på 671 gener vil blive grundigt analyseret i henhold til anbefalingerne fra 2015 fra American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Sanger-sekventering vil også blive brugt til at validere familieadskillelsen af ​​alle påviste kandidatvarianter, som anbefalet. Varianterne er klassificeret i fem kategorier: 1) godartet, 2) sandsynligt godartet, 3) usikker betydning, 4) sandsynligt patogent og 5) patogent. Varianterne med mindre allelfrekvenser >0,05 i enhver af disse databaser: dbSNP, 1000 Genomes Project, ExAC og NHLBI Exome Sequencing Project (ESP6500) vil blive filtreret fra. De udførte analyser vil omfatte beregningsmæssig analyse af DANN, Genomic Evolutionary Rate Profiling++, Likelihood Ratio Test, Mutationstaster, Funktionel analyse gennem Hidden Markov Models-MKL-kodning, Kombineret annotationsafhængig udtømning og EIGEN-score.

De massive sekvensdata, begrænsede kendte sygdomsmekanismer og genetisk heterogenitet bidrager til kompleksiteten af ​​mange tilstande, såsom DEE'er. Således vil afgørende variantfortolkning blive udført i tværfaglige diskussioner blandt genetikere, klinikere, laboratorieteknikere og biostatistikere under regelmæssige formelle genomboard-sessioner (GB) gennem hele undersøgelsesperioden.

GB'er er tværfaglige sessioner afholdt af HUG Center of Genomic Medicine (CGEM), hvor filer med patienter, som hidtil undgik diagnosen, gennemgås. Pædiatrisk neurologi GB'er sammensætter neuropædiatere, pædiatriske radiologer, kliniske genetikere, biologer og bioinformatikere fra Genetisk Medicin afdelingen samt andre speciallæger efter sagerne efterspurgt, f.eks. voksne neurologer, laboratoriemedicinske specialister, immunologer eller andre specialister. Sammen gennemgår de patientens genetiske varianter i gener, der kan forklare sygdommen, og enten afvise dem eller foreslår at bestille yderligere, ekstremt fokuserede undersøgelser for efterfølgende validering af fænotypen. Hvis der ikke kan stilles diagnose, inviteres patienten til at komme tilbage til klinikken for en ny GB 18-24 måneder senere. Vores interne serie viser, at GB'er, siden de blev implementeret i februar 2019, har givet HUG'en mulighed for at øge sin diagnostikrate på DEE fra cirka 45 % til 55 %. GB'er finder sted i et videokonferencerum udstyret til sikker og fortrolig udveksling af patientdata under lægehemmelighed over lange afstande. Genetiske data om patienterne diskuteres, men de kopieres ikke eller overføres fra et center til et andet. Data består af en liste over genetiske varianter i forskellige gener af det målrettede WES, med annoteringer fra offentlige og interne databaser (f.eks. GnomAD) sammen med beregninger fra bioinformatikværktøjer (f.eks. CADD-score). Typisk vil neuropædiatrien præsentere patientens kliniske data, den pædiatriske radiolog vil vise og kommentere MR, genetikeren vil præsentere de klinisk relevante gener, der bærer kandidatvarianter, og det molekylære diagnostiske laboratorieteam af biologer og bioinformatikere vil kvalificere sig. varianterne som patogene, sandsynligvis patogene eller af ukendt betydning. I sidstnævnte tilfælde vil holdet gennemgå litteraturen under GB for at afgøre, om en yderligere test definitivt kan bekræfte en formodet diagnose, dvs. bekræfte fænotypen forårsaget af genet, der bærer en variant, der hidtil er kvalificeret som ukendt betydning.

Vi har ekspertise i næste generations sekventeringstilgange til at understøtte klinisk diagnostik af genetiske sygdomme siden 2012 og leverer bioinformatikplatforme og anden translationel SNP-screening baseret på genom-dækkende associationsstudier. Holdet er stærkt interesseret i at bidrage med vietnamesisk database med genomiske sjældne sygdomme.