早産児におけるマイクロバイオームの確立 (PIMENTO)

以前に行われた研究により、新生児の腸内微生物叢の変化に関連するいくつかの要因が特定されました。 これらには、妊娠期間、出産方法、抗生物質への曝露、および給餌の選択が含まれます。 超低出生体重児の母親は、通常、赤ちゃんのために母乳をさく乳するように勧められています。 これは、敗血症および壊死性腸炎の発生率の低下と関連しています。 これらの影響のいくつかは、母親から母乳に含まれる細菌に関連している可能性があります. 新生児の腸内微生物叢の変化と、新生児に与えられている母乳の微生物叢との相関関係は限られています。 さらに、母乳の微生物叢に対する凍結 (つまり、標準的な母乳の保存方法) の影響は、十分に特徴付けられていません。 さらに、Mother's Own Milk (MOM) がない場合は、ドナーの母乳を提供することが臨床的に適切です。この場合、追加の低温殺菌プロセスがそこに存在する細菌株にも影響を与え、新生児の腸の定着パターンの変化につながる可能性があります。

これは、次世代シーケンス技術を使用して、超早産児の腸内微生物叢の確立と進化を評価する前向き観察研究です。 バイオインフォマティクスを使用してデータを分析し、子宮内での母親から乳児への垂直感染、早産児マイクロバイオームの確立と進化を評価し、新生児集中治療室 (NICU) の管理戦略がマイクロバイオームの組成と介入後の回復をどのように変化させるかを評価します。 この作業は、非常に早産児のための個別化されたプロバイオティクスの開発の基礎を提供し、NICU のマイクロバイオーム保護管理戦略の開発に役立つ詳細な情報を提供します。

募集と同意のプロセス 妊娠 32 週より前に出産の可能性がある場合、妊婦にアプローチします。 研究の目的と参加者に期待されることを詳述した参加者情報リーフレットが提供されます。 研究者による説明も行います。 質問には回答し、審議のための十分な時間を提供します。 幼児と一緒に参加したい場合、参加資格があると推定される参加者は、インフォームド コンセント フォーム (ICF) に署名する必要があります。 彼らは、署名された同意書のコピーを受け取ります。 同意の保留は許可されますが、収集された乳児サンプルはサイトに保管され、同意が得られる前に処理されることはありません。 同意が拒否された場合、収集されたサンプルは直ちに破棄されます。

包含/除外基準は、スクリーニングからインフォームドコンセント、乳児の出産までのすべての時点で評価されます。 出生後に除外基準が満たされた場合、参加者は研究から除外される場合があります。 包含/除外基準については、セクション 4.1/4.2 を参照してください。 多胎分娩は別途登録となります。 サンプルは各乳児から収集されますが、母親のサンプルは 1 セットだけ収集されます。 双子の 1 人が経膣分娩でもう 1 人が帝王切開で出産した場合、可能であれば母親から皮膚と膣スワブの両方を採取します。

人口統計、分娩、助産学、摂食、抗生物質および併存症に関する情報は、参加者から収集されます。 さらに、神経発達を評価するために、乳児および幼児の発達のベイリースケールが2歳で実施されます。

サンプルコレクション

幼児サンプル

胎便と便のサンプル 便のサンプルはベッドサイドで行います。 入院臨床看護師によって行われる直腸スワブは、NICU への入院時に定期的に採取されます。 この時点で、マイクロバイオーム分析のために追加のスワブが採取されます。 新生児の入院中、排泄された最初の胎便のサンプルをおむつから採取し、その後、可能であればルーチンケア中に隔週で乳児のおむつから便を採取します。

乳児の尿 入院中、新生児の看護師が乳児のおむつに滅菌パッド/スワブを入れて毎週尿を採取し、次の定期ケア時に取り出します。

乳児の血液 血液サンプルは、臨床的に示された理由で静脈穿刺時にのみ採取されます。 静脈穿刺とサンプル採取は臨床チームが行います。 乳児の推定総血液量 (eTBV) (80mls/kg) の 1% 以下が、研究目的で任意の時点で収集されます (eTBV=80mls/kg)。 血液サンプル収集のタイムポイントは、生後 1 週間以内です (つまり、 摂食開始前）、生後2～4週間（すなわち、 経腸栄養が完全に確立された後）、および退院前。 研究サンプルの収集のみを目的とした静脈穿刺は許可されません。

母体サンプル

口腔スワブ 口腔サンプルは、無菌スワブを使用して母親から出生後できるだけ早く研究看護師/研究者によって収集されます。

膣スワブ (経膣分娩) 膣スワブは、分娩室で担当の助産師または産科医が母親から採取するか、産後病棟で母親自身が採取します。

皮膚スワブ（帝王切開分娩） 皮膚スワブは、出産後に研究看護師/研究者によって母親から入手されます。 参加者の病院のリストバンドの下で、手首の内側から採取します。

母体の糞便サンプル 参加者には、糞便サンプルを採取するためのキットと説明書が提供されます。 サンプルは、研究チームによって提供および収集され次第、凍結されます。

母乳 MOMの母乳サンプルは、研究を通して母親から収集されます。 乳児が NICU に十分に供給されている場合、母親は 2 週間ごとに 5 ～ 15 ml の母乳サンプル (可能であれば) を提供するよう求められます。

サンプル分析

乳児便の分析 異種発現メタゲノム DNA のハイスループットスクリーニングは、機能性を調べる手段として検討されます。 特定の炭水化物源を代謝する全体的な能力（つまり 母乳）。 すべての乳児の糞便から DNA を抽出し、続いてユニバーサル 16s RNA プライマーを使用して PCR アンプリコンを生成し、PCR 産物を精製および定量化します。 次に、個体ごとに 16S rRNA 遺伝子フラグメントに対して Illumina Miseq シーケンスを実行します。 この技術から生成される膨大な量のデータにより、その後のバイオインフォマティクスおよび統計分析が不可欠です。

乳児尿の分析 非ターゲット LC-MS アッセイは、ハイブリッド リニア イオン トラップ フーリエ変換 (LTQ FT) Orbitrap 質量分析計を使用して実行されます。 XCMS オンライン ポータル (https://xcmsonline.scripps.edu/) データ処理 (アライメント、ピーク ピッキング、ゼロ ピークの再統合、特徴のグループ化、および品質管理サンプルの評価) に使用されます。 化合物に注釈を付けるために、最も豊富で最も統計的に有意な特徴に基づいて選択戦略が使用されます。 代謝産物の同定を支援するために、Spearman 相関分析を使用して追加のクラスタリング分析を実行します。

乳児血液の分析 血液サンプルは、機能メタボロミクスに関連して検査されます。これには、ショットガンメタボロミクスを使用した分析、および既知の微生物シグナル伝達グループとの関係を探す同じ時点での便マイクロバイオームのハイスループットデータセットとの比較が含まれますが、これらに限定されません。

母体サンプルの分析 周産期の口腔、膣、および皮膚の微生物組成を、一般的な臨床データおよび人口統計データと併せて分析します。 母体の微生物叢のプロファイルと以前の研究との比較が行われ、母子感染における微生物の垂直方向および水平方向の移動を評価するために、初期乳児の腸内細菌叢データでデータが調べられます。 サンプルから DNA を抽出した後、ユニバーサル 16s RNA プライマーを使用して PCR アンプリコンを生成し、PCR 産物を精製および定量化します。 次に、個体ごとに 16S rRNA 遺伝子フラグメントに対して Illumina Miseq シーケンスを実行します。 この技術から生成される膨大な量のデータにより、その後のバイオインフォマティクスおよび統計分析が不可欠です。

糞便微生物叢の組成は、おそらくシーケンシングや定量的 PCR を含むがこれらに限定されない最先端の方法を使用して、研究者によって微生物含有量について分析されます。

研究者は、母体の糞便微生物組成と糞便微生物メタゲノムを、一般的な臨床および人口統計データと併せて分析します。 糞便中の微生物組成配列は、どの細菌の種類が存在するかを明らかにし、メタゲノム解析は微生物負荷の代謝能を示します。 異なる集団の機能を調べる手段として、異種発現メタゲノム DNA のハイスループット スクリーニングを使用することを提案します。 特定の炭水化物源を代謝する全体的な能力、毒素の変換など. DNA は、乳児の糞便について概説したように、母体の糞便から抽出されます。

母乳の分析 研究者は、一般的な臨床データおよび人口統計データと併せて、牛乳の微生物組成および微生物メタゲノムを分析します。 細菌プロファイルは、母体の腸内微生物叢について報告された以前の研究と比較され、データを乳児便の微生物叢データと関連付けて、母子感染における微生物の水平移動を評価します。 異種発現メタゲノム DNA のハイスループット スクリーニングは、機能性を調べる手段として使用されます。 特定の炭水化物源を代謝する全体的な能力（例 母乳オリゴ糖）。 DNAはすべての被験者の母乳から抽出され、続いてユニバーサル16s RNAプライマーを使用したPCRアンプリコンの生成、PCR産物の精製および定量化が行われます。 次に、個体ごとに 16S rRNA 遺伝子フラグメントに対して Illumina Miseq シーケンスを実行します。 バクテリオファージは、マイクロバイオーム構成の重要な調節因子であり、捕食者と被食者の間の適切な乳生態系の平衡を維持する上で重要な役割を果たします。 バクテリオファージは、配列に依存しないメタゲノム配列決定のために、ヒト乳から分離されます。 免疫グロブリンに関連するバクテリオファージも同様に分離され、配列決定されます。 この技術から生成される膨大な量のデータにより、その後のバイオインフォマティクスおよび統計分析が不可欠です。 バイオインフォマティクス分析は、他の生物学的サンプルについて前述したものと同じです。

すべての分析方法は、最先端の方法論に従って適宜更新されます。

サンプルの保管 すべての母体サンプルは、研究者によって直ちに収集され、APC Microbiome Ireland のオフサイト研究所に輸送され、できるだけ早く処理され、保管のために凍結されるまで、-20°C で現場で凍結されます。

NICU で得られたすべての乳児サンプルは、APC Microbiome Ireland のオフサイト研究所に輸送され、できるだけ早く処理され、保存のために凍結されるまで、研究用冷凍庫に保存されます。

バイオインフォマティクス分析 バイオインフォマティクス分析には以下が含まれます。300 bp ペアエンドリードは FLASH を使用して組み立てられ、ツールの QIIME スイートは、ペアエンドリードのさらなる処理に使用されます。これには、品質フィルタリング、不一致バーコードおよび長さ未満の配列の除去が含まれます。しきい値。 OTU シーケンスは PyNAST を使用して整列され、SILVA SSURef データベースは分類法を決定するために使用されます。 アルファとベータの多様性は、QIIME を使用して計算されます。 最後に、主座標分析 (PCoA) プロットを使用して、UniFrac 距離行列に基づいてベータ多様性の違いを視覚化します。

主要エンドポイント 主要な研究エンドポイントは、登録された最後の参加者の 24 か月の評価になります。 この研究は、18 か月間に妊娠 32 週未満で生まれた 80 ～ 100 人の乳児を登録することを目的としています。 分析は出生後の最初のサンプルから実行され、乳児の腸に存在する初期の植民地形成者を検出し（垂直感染による可能性が高い）、これらの早産児のマイクロバイオーム確立のパターンを決定します。

規制および行政手続き この調査は、1964 年ヘルシンキ宣言の 2013 年 10 月、ブラジルのフォルタレザ版に従って実施されます。 プロトコルと参加者情報リーフレット/ICF は、コーク教育病院の臨床研究倫理委員会によって承認されます。

参加者情報/インフォームド コンセント この研究で使用されるインフォームド コンセント フォーム、および研究中に行われた変更は、使用前にコーク教育病院の臨床研究倫理委員会によって前向きに承認されています。 各インフォームド コンセント フォームには、1988 年および 2003 年の ICH E6 ガイドラインおよび 1988 年と 2003 年のデータ保護法、および 2018 年 5 月 25 日からの GDPR によって現在要求されているすべての関連要素が含まれます。

参加者は、不利益を被ることなく、いつでも研究への参加を辞退することができます。 さらに、研究者は、参加者にとって最善の利益である場合、研究から参加者を撤回することがあります。 参加者が研究から撤退した理由は、参加者のケースノートに記録されます。

GCP および記録保持 研究は、最新の国際調和会議 (ICH) のグッド クリニカル プラクティス (GCP) ガイドラインに従って管理および実施されます。 治験責任医師は、医療および臨床研究の実践の最高水準に従って、本書に記載されているすべてのサービス、または本書に記載されているサービスに付随するすべてのサービスを実行または直接監督します。 この調査中に収集されたデータの使用と保管は、一般データ保護規則 (GDPR) (欧州議会および理事会の規則 (EU) 2016/679) および 2018 年データ保護法 (セクション 36(2) ) (健康研究) 規則 2018.