Mikrobiom-Etablierung bei Frühgeborenen (PIMENTO)

Frühere Arbeiten haben mehrere Faktoren identifiziert, die mit Veränderungen im Darmmikrobiom von Neugeborenen zusammenhängen. Dazu gehören das Gestationsalter, die Art der Geburt, die Exposition gegenüber Antibiotika und die Wahl der Nahrungsaufnahme. Mütter von Säuglingen mit sehr niedrigem Geburtsgewicht werden normalerweise ermutigt, Muttermilch für ihr Baby abzupumpen. Dies ist mit geringeren Sepsisraten und nekrotisierenden Enterokolitiden verbunden. Einige dieser Wirkungen können mit den Bakterien zusammenhängen, die von ihrer Mutter in die Muttermilch aufgenommen wurden. Korrelationen zwischen Veränderungen im Darmmikrobiom des Neugeborenen und der Mikrobiota der Milch, mit der sie gefüttert werden, sind begrenzt. Darüber hinaus ist die Wirkung des Einfrierens (d. h. der Standardpraxis zur Aufbewahrung von Muttermilch) auf die Mikrobiota der Muttermilch nicht gut charakterisiert worden. Darüber hinaus ist es in Abwesenheit von Muttermilch (MOM) klinisch angemessen, Spendermilch anzubieten, wobei der zusätzliche Prozess der Pasteurisierung auch die darin vorhandenen Bakterienstämme beeinträchtigen und zu einem veränderten Besiedlungsmuster des Neugeborenendarms führen kann.

Dies ist eine prospektive Beobachtungsstudie, die die Etablierung und Entwicklung des Darmmikrobioms von Frühgeborenen unter Verwendung von Next-Generation-Sequencing-Techniken bewertet. Die Daten werden mithilfe von Bioinformatik analysiert, um die vertikale Übertragung von der Mutter auf das Kind im Mutterleib, die Etablierung und Entwicklung des Frühgeborenen-Mikrobioms zu bewerten und zu bewerten, wie die Managementstrategien der Neugeborenen-Intensivstation (NICU) die Zusammensetzung des Mikrobioms und die Erholung nach Eingriffen verändern. Diese Arbeit wird detaillierte Informationen liefern, die die Grundlage für die Entwicklung individualisierter Probiotika für sehr frühgeborene Säuglinge bilden und zur Entwicklung von Strategien zum Schutz des Mikrobioms auf der Neugeborenen-Intensivstation beitragen können.

Rekrutierungs- und Zustimmungsprozess Schwangere Frauen werden kontaktiert, wenn die Möglichkeit einer Entbindung vor der 32. Schwangerschaftswoche besteht. Eine Informationsbroschüre für die Teilnehmer wird bereitgestellt, in der der Zweck der Studie und die Erwartungen der Teilnehmer aufgeführt sind. Die Studie wird auch von einem Forscher erklärt. Fragen werden beantwortet und es wird ausreichend Zeit zur Beratung gegeben. Wenn sie mit ihrem Kleinkind teilnehmen möchten, müssen die mutmaßlich in Frage kommenden Teilnehmer die Einwilligungserklärung (ICF) unterschreiben. Sie erhalten eine Kopie der unterschriebenen Einverständniserklärung. Eine aufgeschobene Zustimmung ist zulässig, aber alle gesammelten Säuglingsproben werden vor Ort aufbewahrt und nicht verarbeitet, bevor die Zustimmung eingeholt wurde. Wird die Zustimmung verweigert, werden alle entnommenen Proben unverzüglich verworfen.

Die Einschluss-/Ausschlusskriterien werden zu allen Zeitpunkten vom Screening bis zur Einverständniserklärung bis zur Entbindung des Säuglings bewertet. Die Teilnehmer können von der Studie ausgeschlossen werden, wenn die Ausschlusskriterien postnatal erfüllt sind. Einschluss-/Ausschlusskriterien siehe Abschnitte 4.1/4.2. Mehrlingsgeburten werden separat erfasst. Von jedem Säugling werden Proben entnommen, es würde jedoch nur ein Satz mütterlicher Proben entnommen. Für den Fall, dass ein Zwilling vaginal und der andere per Kaiserschnitt entbunden wird, werden nach Möglichkeit sowohl Haut- als auch Vaginalabstriche von der Mutter entnommen.

Informationen zu Demografie, Geburt, Auxologie, Ernährung, Antibiotika und Komorbiditäten werden von den Teilnehmern gesammelt. Zusätzlich wird eine Bayley-Skala der Säuglings- und Kleinkindentwicklung im Alter von 2 Jahren durchgeführt, um die neurologische Entwicklung zu beurteilen.

Beispielsammlung

Säuglingsproben

Mekonium- und Stuhlproben Die Stuhlprobe wird am Krankenbett entnommen. Rektalabstriche, die von der aufnehmenden klinischen Krankenschwester durchgeführt werden, werden routinemäßig bei der Aufnahme auf der neonatologischen Intensivstation entnommen. Zu diesem Zeitpunkt wird ein zusätzlicher Abstrich zur Mikrobiomanalyse entnommen. Während der Neugeborenenaufnahme wird eine Probe des ersten ausgeschiedenen Mekoniums aus der Windel entnommen, und danach wird, wenn möglich, während der routinemäßigen Pflege zweiwöchentlich Stuhl aus der Windel des Säuglings entnommen.

Säuglingsurin Während des stationären Aufenthaltes wird der Urin wöchentlich von der Neugeborenen-Pflegekraft gesammelt, indem ein steriler Tupfer in die Windel des Säuglings gelegt wird, der dann bei der nächsten routinemäßigen Versorgung entfernt wird.

Säuglingsblut Blutproben werden nur aus klinisch indizierten Gründen zum Zeitpunkt der Venenpunktion entnommen. Venenpunktion und Probenentnahme werden vom Klinikteam durchgeführt. Zu Forschungszwecken wird zu keinem Zeitpunkt mehr als 1 % des geschätzten Gesamtblutvolumens (eTBV) (eTBV) (80 ml/kg) eines Säuglings entnommen (eTBV = 80 ml/kg). Zeitpunkte für die Blutentnahme liegen innerhalb der ersten Lebenswoche (d.h. vor Beginn der Fütterung), zwischen 2 und 4 Lebenswochen (d. h. sobald die enterale Ernährung vollständig etabliert ist) und vor der Entlassung. Eine Venenpunktion zum alleinigen Zweck der Entnahme einer Forschungsprobe ist nicht gestattet.

Mütterliche Proben

Orale Abstriche Orale Proben werden von der Forschungsschwester/dem Prüfarzt so bald wie möglich nach der Geburt von der Mutter mit einem sterilen Tupfer entnommen.

Vaginalabstrich (Vaginalgeburten) Ein Vaginalabstrich wird bei der Mutter von der behandelnden Hebamme oder dem Geburtshelfer im Entbindungssaal oder von der Mutter selbst auf der Wochenbettstation abgenommen.

Hautabstrich (Entbindung durch Kaiserschnitt) Ein Hautabstrich wird von der Forschungsschwester/Untersucher nach der Entbindung von der Mutter entnommen. Es wird von der Innenseite des Handgelenks unter dem Krankenhausarmband des Teilnehmers gesammelt.

Stuhlproben der Mutter Den Teilnehmern werden Kits und Anweisungen zur Entnahme von Stuhlproben zur Verfügung gestellt. Proben werden eingefroren, sobald sie bereitgestellt und vom Forschungsteam gesammelt werden.

Muttermilch Muttermilchproben von MOM werden während der gesamten Studie von Müttern gesammelt. Mütter werden gebeten, (wenn möglich) alle zwei Wochen eine 5-15-ml-Muttermilchprobe abzugeben, während sich ihr Kind auf der Neugeborenen-Intensivstation befindet, sofern es über ausreichende Vorräte verfügt.

Probenanalyse

Analyse für Säuglingsstuhl Es wird ein Hochdurchsatz-Screening von heterolog exprimierter metagenomischer DNA untersucht, um die Funktionalität z. allgemeine Fähigkeit, bestimmte Kohlenhydratquellen zu metabolisieren (d. h. Muttermilch). DNA wird aus den Fäkalien aller Säuglinge extrahiert, gefolgt von der Generierung von PCR-Amplikons unter Verwendung universeller 16s-RNA-Primer, Reinigung und Quantifizierung von PCR-Produkten. Die Illumina Miseq-Sequenzierung wird dann an 16S-rRNA-Genfragmenten pro Individuum durchgeführt. Aufgrund der enormen Datenmengen, die durch diese Technologie generiert werden, ist eine anschließende bioinformatische und statistische Analyse unerlässlich.

Analyse von Säuglingsurin Ungezielte LC-MS-Assays werden mit einem linearen Hybrid-Ionenfallen-Fourier-Transformations(LTQ FT)-Orbitrap-Massenspektrometer durchgeführt. Das XCMS Online-Portal (https://xcmsonline.scripps.edu/) wird für die Datenverarbeitung verwendet (Alignment, Peak-Picking, Zero-Peak-Reintegration, Gruppierung von Merkmalen und Bewertung von Qualitätskontrollproben). Um Verbindungen zu annotieren, wird eine Auswahlstrategie verwendet, die auf den am häufigsten vorkommenden und statistisch signifikantesten Merkmalen basiert. Um die Identifizierung von Metaboliten zu unterstützen, wird eine zusätzliche Clustering-Analyse unter Verwendung der Spearman-Korrelationsanalyse durchgeführt.

Analyse von Säuglingsblut Blutproben werden in Bezug auf funktionelle Metabolomik untersucht, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Analyse unter Verwendung von Shotgun-Metabolomik und Vergleich mit den Hochdurchsatzdatensätzen des Stuhlmikrobioms zu denselben Zeitpunkten, um nach Beziehungen zu bekannten mikrobiellen Signalgruppen zu suchen.

Analyse mütterlicher Proben Die peripartale orale, vaginale und hautmikrobiologische Zusammensetzung wird in Verbindung mit allgemeinen klinischen und demografischen Daten analysiert. Die Profile der mütterlichen Mikrobiota werden mit früheren Studien verglichen, und die Daten werden mit den Darmmikrobiomdaten des frühen Säuglings untersucht, um die vertikale und horizontale Übertragung von Mikroorganismen bei der Mutter-Kind-Übertragung zu bewerten. DNA wird aus Proben extrahiert, gefolgt von der Generierung von PCR-Amplikons unter Verwendung universeller 16s-RNA-Primer, Reinigung und Quantifizierung von PCR-Produkten. Die Illumina Miseq-Sequenzierung wird dann an 16S-rRNA-Genfragmenten pro Individuum durchgeführt. Aufgrund der enormen Datenmengen, die durch diese Technologie generiert werden, ist eine anschließende bioinformatische und statistische Analyse unerlässlich.

Die Zusammensetzung der Stuhlmikrobiota wird von den Forschern unter Verwendung modernster Methoden, möglicherweise einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sequenzierung, und quantitativer PCR auf ihren mikrobiellen Gehalt analysiert.

Die Ermittler analysieren die fäkale mikrobielle Zusammensetzung der Mutter und das fäkale mikrobielle Metagenom in Verbindung mit allgemeinen klinischen und demografischen Daten. Sequenzen der mikrobiellen Zusammensetzung des Stuhls zeigen, welche Bakterientypen vorhanden sind, und metagenomische Analysen zeigen das metabolische Potenzial der mikrobiellen Belastung. Wir schlagen vor, Hochdurchsatz-Screening von heterolog exprimierter metagenomischer DNA zu verwenden, um die Funktionalität verschiedener Populationen zu untersuchen, z. allgemeine Fähigkeit, bestimmte Kohlenhydratquellen zu verstoffwechseln, Umwandlung von Toxinen usw. DNA wird aus dem mütterlichen Kot extrahiert, wie für den Säuglingsstuhl beschrieben.

Analyse für Muttermilch Die Forscher analysieren die mikrobielle Zusammensetzung der Milch und das mikrobielle Metagenom in Verbindung mit allgemeinen klinischen und demografischen Daten. Bakterienprofile werden mit früheren Studien verglichen, die über das mütterliche Darmmikrobiom berichtet wurden, und die Daten mit den Mikrobiomdaten des Säuglingsstuhls korrelieren, um die horizontale Übertragung von Mikroorganismen bei der Mutter-Kind-Übertragung zu bewerten. Hochdurchsatz-Screening von heterolog exprimierter metagenomischer DNA wird verwendet, um die Funktionalität zu untersuchen, z. allgemeine Fähigkeit, bestimmte Kohlenhydratquellen (z. menschliche Milch-Oligosaccharide). DNA wird aus der Muttermilch aller Probanden extrahiert, gefolgt von der Generierung von PCR-Amplikons unter Verwendung universeller 16s-RNA-Primer, Reinigung und Quantifizierung von PCR-Produkten. Die Illumina Miseq-Sequenzierung wird dann an 16S-rRNA-Genfragmenten pro Individuum durchgeführt. Bakteriophagen sind wichtige Regulatoren der Zusammensetzung des Mikrobioms und spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des angemessenen Gleichgewichts des Milchökosystems zwischen Räuber und Beute. Bakteriophagen werden zum Zwecke der sequenzunabhängigen metagenomischen Sequenzierung aus Muttermilch isoliert. Diese mit Immunglobulinen assoziierten Bakteriophagen werden in ähnlicher Weise isoliert und sequenziert. Aufgrund der enormen Datenmengen, die durch diese Technologie generiert werden, ist eine anschließende bioinformatische und statistische Analyse unerlässlich. Die bioinformatische Analyse ist die gleiche wie zuvor für die anderen biologischen Proben erwähnt.

Alle Analysemethoden werden gegebenenfalls gemäß dem Stand der Technik aktualisiert.

Probenlagerung Alle mütterlichen Proben werden sofort vom Forscher entnommen und vor Ort bei -20 °C eingefroren, bis sie zur schnellstmöglichen Verarbeitung und zum Einfrieren zur Lagerung in das externe Labor von APC Microbiome Ireland transportiert werden können.

Alle auf der neonatologischen Intensivstation entnommenen Säuglingsproben werden im Forschungsgefrierschrank gelagert, bis sie so schnell wie möglich zur Verarbeitung und zum Einfrieren zur Lagerung in das externe Labor von APC Microbiome Ireland transportiert werden können.

Bioinformatische Analyse Die bioinformatische Analyse umfasst Folgendes: 300-bp-Paired-End-Reads werden mit FLASH zusammengestellt, und die QIIME-Tool-Suite wird für die weitere Verarbeitung von Paired-End-Reads verwendet, einschließlich Qualitätsfilterung und Entfernung nicht übereinstimmender Barcodes und Sequenzen unter der Länge Schwellen. OTU-Sequenzen werden mit PyNAST ausgerichtet und die SILVA SSURef-Datenbank wird verwendet, um die Taxonomie zu bestimmen. Alpha- und Beta-Diversitäten werden mit QIIME berechnet. Schließlich werden Diagramme der Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) verwendet, um Unterschiede in der Beta-Diversität basierend auf UniFrac-Distanzmatrizen zu visualisieren.

Primärer Endpunkt Der primäre Studienendpunkt ist die 24-Monats-Beurteilung des letzten eingeschriebenen Teilnehmers. Die Studie zielt darauf ab, 80 bis 100 Säuglinge, die vor der 32. Schwangerschaftswoche geboren wurden, über einen Zeitraum von 18 Monaten aufzunehmen. Anhand der ersten Proben nach der Geburt werden Analysen durchgeführt, um vorhandene frühe Kolonisatoren des Säuglingsdarms (wahrscheinlich durch vertikale Übertragung) zu erkennen und Muster der Mikrobiombildung bei diesen Frühgeborenen zu bestimmen.

Regulatorische und administrative Verfahren Die Studie wird gemäß der Version Fortaleza, Brasilien, Oktober 2013 der Deklaration von Helsinki 1964 durchgeführt. Das Protokoll und die Informationsbroschüre für Teilnehmer/ICF werden von der Ethikkommission für klinische Forschung der Cork Teaching Hospitals genehmigt.

Teilnehmerinformation/Einverständniserklärung Das in dieser Studie verwendete Einverständniserklärungsformular und alle während der Studie vorgenommenen Änderungen wurden vor der Verwendung prospektiv von der Ethikkommission für klinische Forschung der Cork Teaching Hospitals genehmigt. Jedes Einwilligungsformular enthält alle relevanten Elemente, die derzeit von der ICH E6-Richtlinie für gute klinische Praxis (GCP) und dem Datenschutzgesetz von 1988 und 2003 sowie der DSGVO vom 25. Mai 2018 gefordert werden.

Die Teilnehmer können jederzeit ohne Nachteile von der Teilnahme an der Studie zurücktreten. Darüber hinaus kann der Prüfarzt Teilnehmer aus der Studie ausschließen, wenn dies im besten Interesse des Teilnehmers ist. Der Grund für den Austritt der Teilnehmer aus der Studie wird in den Fallnotizen der Teilnehmer dokumentiert.

GCP und Aufbewahrung von Aufzeichnungen Die Studie wird gemäß den neuesten Richtlinien der International Conference on Harmonisation (ICH) für gute klinische Praxis (GCP) verwaltet und durchgeführt. Der Prüfarzt wird alle hierin beschriebenen oder mit den hierin beschriebenen Dienstleistungen zusammenhängenden Dienstleistungen gemäß den höchsten Standards der medizinischen und klinischen Forschungspraxis erbringen oder deren Erbringung direkt überwachen. Die Nutzung und Speicherung der während dieser Studie erhobenen Daten erfolgt im Einklang mit der Datenschutz-Grundverordnung (DSGVO) (Verordnung (EU) 2016/679 des Europäischen Parlaments und des Rates) und dem Datenschutzgesetz 2018 (Abschnitt 36(2) ) (Gesundheitsforschung) Verordnungen 2018.