Ustanowienie mikrobiomu u wcześniaków (PIMENTO)

Wcześniejsze prace pozwoliły zidentyfikować kilka czynników związanych ze zmianami w mikrobiomie jelitowym noworodków. Obejmują one wiek ciążowy, sposób porodu, ekspozycję na antybiotyki i wybór karmienia. Matki niemowląt o bardzo niskiej masie urodzeniowej są zwykle zachęcane do odciągania mleka matki dla swojego dziecka. Jest to związane z niższym odsetkiem posocznicy i martwiczego zapalenia jelit. Niektóre z tych efektów mogą być związane z bakteriami otrzymanymi w mleku matki. Korelacje między zmianami mikrobiomu jelitowego noworodków a mikroflorą mleka, którym są karmione, są ograniczone. Co więcej, wpływ zamrażania (tj. standardowej praktyki przechowywania mleka matki) na mikroflorę mleka matki nie został dobrze scharakteryzowany. Ponadto, w przypadku braku mleka matki (MOM), klinicznie właściwe jest podawanie mleka kobiecego od dawczyń, gdzie dodatkowy proces pasteryzacji może również wpływać na obecne w nim szczepy bakteryjne i prowadzić do zmiany wzorca kolonizacji jelita noworodka.

Jest to prospektywne badanie obserwacyjne, które oceni ustanowienie i ewolucję mikrobiomu jelitowego bardzo wcześniaków przy użyciu technik sekwencjonowania nowej generacji. Dane zostaną przeanalizowane za pomocą bioinformatyki w celu oceny transmisji pionowej z matki na niemowlę w macicy, ustanowienia i ewolucji mikrobiomu wcześniaka oraz oceny, w jaki sposób strategie zarządzania oddziałem intensywnej terapii noworodków (NICU) zmieniają skład mikrobiomu i powrót do zdrowia po interwencjach. Ta praca dostarczy szczegółowych informacji, które mogą stanowić podstawę do opracowania zindywidualizowanych probiotyków dla bardzo wcześniaków i mogą pomóc w opracowaniu strategii ochrony mikrobiomu dla OIOM-ów dla noworodków.

Proces rekrutacji i zgody Kobiety w ciąży będą przyjmowane, jeśli istnieje możliwość porodu przed 32 tygodniem ciąży. Zostanie dostarczona ulotka informacyjna dla uczestników, która szczegółowo określi cel badania i czego można oczekiwać od uczestników. Badanie zostanie również wyjaśnione przez badacza. Otrzymamy odpowiedzi na pytania i zapewnimy wystarczającą ilość czasu na naradę. Jeśli chcą uczestniczyć ze swoim niemowlęciem, przypuszczalnie kwalifikujący się uczestnicy muszą podpisać formularz świadomej zgody (ICF). Otrzymają kopię podpisanego formularza zgody. Zgoda odroczona będzie dozwolona, ​​ale wszelkie pobrane próbki niemowląt będą przechowywane na miejscu i nie będą przetwarzane przed uzyskaniem zgody. Jeśli zgoda zostanie odrzucona, wszelkie pobrane próbki zostaną natychmiast odrzucone.

Kryteria włączenia/wyłączenia będą oceniane we wszystkich punktach czasowych od badania przesiewowego do świadomej zgody na poród niemowlęcia. Uczestnicy mogą zostać wycofani z badania, jeśli kryteria wykluczenia zostaną spełnione po urodzeniu. Kryteria włączenia/wyłączenia znajdują się w sekcjach 4.1/4.2. Porody mnogie będą rejestrowane oddzielnie. Próbki zostaną pobrane od każdego niemowlęcia, ale zostanie pobrany tylko jeden zestaw próbek od matki. W przypadku, gdy jedno z bliźniąt rodzi się drogą pochwową, a drugie przez cesarskie cięcie, w miarę możliwości pobierane są wymazy ze skóry iz pochwy.

Od uczestników zostaną zebrane informacje dotyczące danych demograficznych, porodu, auksologii, karmienia, antybiotyków i chorób współistniejących. Ponadto w wieku 2 lat zostanie przeprowadzona skala Bayleya rozwoju niemowląt i małych dzieci, aby ocenić rozwój neurologiczny.

Kolekcja próbek

Próbki dla niemowląt

Próbki smółki i kału Pobieranie próbek kału zostanie przeprowadzone przy łóżku chorego. Wymazy z odbytu, wykonywane przez pielęgniarkę przyjmującą, są rutynowo pobierane przy przyjęciu na OIOM. W tym czasie zostanie pobrany dodatkowy wymaz do analizy mikrobiomu. Podczas przyjęcia noworodka z pieluchy zostanie pobrana próbka pierwszej wydalonej smółki, a następnie kału z pieluchy niemowlęcia co dwa tygodnie, jeśli to możliwe, podczas rutynowych czynności pielęgnacyjnych.

Mocz niemowlęcia Podczas pobytu w szpitalu mocz będzie zbierany co tydzień przez pielęgniarkę neonatologiczną poprzez umieszczenie sterylnego wacika/wacików w pieluszce niemowlęcia, które następnie zostaną usunięte przy następnych rutynowych czynnościach pielęgnacyjnych.

Krew niemowlęcia Próbki krwi będą pobierane wyłącznie w momencie nakłucia żyły z klinicznie wskazanego powodu. Zespół kliniczny przeprowadzi nakłucie żyły i pobranie próbki. Nie więcej niż 1% szacowanej całkowitej objętości krwi niemowlęcia (eTBV) (80 ml/kg) zostanie pobrane w dowolnym momencie do celów badawczych (eTBV=80 ml/kg). Punkty czasowe pobierania próbek krwi będą mieścić się w pierwszym tygodniu życia (tj. przed rozpoczęciem dokarmiania), między 2 a 4 tygodniem życia (tj. po całkowitym ustaleniu żywienia dojelitowego) i przed wypisem. Nakłucie żyły wyłącznie w celu pobrania próbki do badań nie będzie dozwolone.

Próbki matki

Wymazy z jamy ustnej Próbki z jamy ustnej zostaną pobrane przez pielęgniarkę badawczą/badacza jak najszybciej po urodzeniu od matki przy użyciu sterylnego wymazu.

Wymaz z pochwy (poród drogami natury) Wymaz z pochwy zostanie pobrany od matki przez położną lub położnika na sali porodowej lub przez samą matkę na oddziale poporodowym.

Wymaz ze skóry (poród przez cesarskie cięcie) Wymaz ze skóry zostanie pobrany od matki przez pielęgniarkę badawczą/badacza po porodzie. Zostanie on pobrany z wewnętrznej strony nadgarstka pod szpitalną opaską na nadgarstek uczestnika.

Próbki kału matki Uczestnicy otrzymają zestawy i instrukcje pobierania próbek kału. Próbki zostaną zamrożone, gdy tylko zostaną dostarczone i pobrane przez zespół badawczy.

Mleko matki Próbki mleka matki MOM będą pobierane od matek przez cały czas trwania badania. Matki zostaną poproszone o dostarczenie 5-15 ml próbki mleka matki (jeśli to możliwe) co dwa tygodnie, gdy ich dziecko przebywa na OIOM-ie dla noworodków, jeśli ma ono odpowiednie zapasy.

Analiza próbki

Analiza stolca niemowlęcia Wysokowydajne badania przesiewowe metagenomowego DNA ulegającego ekspresji heterologicznej zostaną zbadane jako sposób przyjrzenia się funkcjonalności, np. ogólną zdolność do metabolizowania pewnych źródeł węglowodanów (tj. mleko matki). DNA zostanie wyekstrahowane z kału wszystkich niemowląt, a następnie wytworzone zostaną amplikony PCR przy użyciu uniwersalnych starterów 16s RNA, oczyszczone i zliczone ilościowo produktów PCR. Sekwencjonowanie Illumina Miseq zostanie następnie przeprowadzone na fragmentach genów 16S rRNA na osobnika. Ze względu na ogromną ilość danych generowanych za pomocą tej technologii niezbędna jest późniejsza analiza bioinformatyczna i statystyczna.

Analiza moczu niemowląt Niekierowane testy LC-MS zostaną przeprowadzone za pomocą spektrometru mas Orbitrap z hybrydową liniową pułapką jonową z transformacją Fouriera (LTQ FT). Portal internetowy XCMS (https://xcmsonline.scripps.edu/) będzie używany do przetwarzania danych (dopasowanie, zbieranie pików, reintegracje pików zerowych, grupowanie cech i ocena próbek do kontroli jakości). Aby dodać adnotacje do związków, zostanie zastosowana strategia selekcji oparta na najliczniejszych i najbardziej statystycznie istotnych cechach. Aby pomóc w identyfikacji metabolitów, zostanie przeprowadzona dodatkowa analiza skupień przy użyciu analizy korelacji Spearmana.

Analiza krwi niemowląt Próbki krwi zostaną zbadane w odniesieniu do funkcjonalnej metabolomiki, w tym między innymi analizy z wykorzystaniem metabolomiki shotgun i porównania z zestawami danych mikrobiomu kału o dużej przepustowości w tym samym czasie, szukając powiązań ze znanymi mikrobiologicznymi grupami sygnalizacyjnymi.

Analiza próbek matczynych Przeanalizowany zostanie okołoporodowy skład mikrobiologiczny jamy ustnej, pochwy i skóry w połączeniu z ogólnymi danymi klinicznymi i demograficznymi. Dokonane zostanie porównanie profili mikroflory matczynej z poprzednimi badaniami, a dane zostaną przeanalizowane z danymi dotyczącymi mikrobiomu jelitowego wczesnego niemowlęcia, aby ocenić pionowy i poziomy transfer mikroorganizmów w transmisji matka-niemowlę. DNA zostanie wyekstrahowane z próbek, a następnie wygenerowane zostaną amplikony PCR przy użyciu uniwersalnych starterów 16s RNA, oczyszczone i zliczone ilościowo produktów PCR. Sekwencjonowanie Illumina Miseq zostanie następnie przeprowadzone na fragmentach genów 16S rRNA na osobnika. Ze względu na ogromną ilość danych generowanych za pomocą tej technologii niezbędna jest późniejsza analiza bioinformatyczna i statystyczna.

Skład mikroflory kału zostanie przeanalizowany pod kątem zawartości drobnoustrojów przez badaczy przy użyciu najnowocześniejszych metod, w tym między innymi sekwencjonowania i ilościowego PCR.

Badacze przeanalizują skład drobnoustrojów w kale matki i metagenom drobnoustrojów w kale w połączeniu z ogólnymi danymi klinicznymi i demograficznymi. Sekwencje składu drobnoustrojów kałowych ujawnią, jakie typy bakterii są obecne, a analizy metagenomiczne wskażą potencjał metaboliczny ładunku drobnoustrojów. Proponujemy zastosowanie wysokowydajnych badań przesiewowych metagenomicznego DNA ulegającego ekspresji heterologicznie jako sposobu na przyjrzenie się funkcjonalności różnych populacji, np. ogólna zdolność do metabolizowania pewnych źródeł węglowodanów, przemiany toksyn itp. DNA zostanie wyekstrahowane z kału matki, jak opisano dla stolca niemowlęcia.

Analiza mleka matki Badacze przeanalizują skład mikrobiologiczny mleka i metagenom drobnoustrojów w połączeniu z ogólnymi danymi klinicznymi i demograficznymi. Profile bakteryjne zostaną porównane z wcześniejszymi badaniami dotyczącymi mikrobiomu jelitowego matki i skorelowane z danymi dotyczącymi mikrobiomu stolca niemowlęcia, aby ocenić poziome przenoszenie mikroorganizmów w transmisji matka-niemowlę. Wysokowydajne badania przesiewowe metagenomicznego DNA ulegającego ekspresji heterologicznej zostaną wykorzystane jako sposób na sprawdzenie funkcjonalności, np. ogólną zdolność do metabolizowania pewnych źródeł węglowodanów (np. oligosacharydy ludzkiego mleka). DNA zostanie wyekstrahowane z mleka wszystkich pacjentek, a następnie wytworzone zostaną amplikony PCR przy użyciu uniwersalnych starterów 16s RNA, oczyszczone i zliczone ilościowo produktów PCR. Sekwencjonowanie Illumina Miseq zostanie następnie przeprowadzone na fragmentach genów 16S rRNA na osobnika. Bakteriofagi są ważnymi regulatorami składu mikrobiomu i odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu odpowiedniej równowagi ekosystemu mleka pomiędzy drapieżnikiem a ofiarą. Bakteriofag zostanie wyizolowany z mleka kobiecego w celu niezależnego od sekwencji sekwencjonowania metagenomicznego. Te bakteriofagi związane z immunoglobulinami będą podobnie izolowane i sekwencjonowane. Ze względu na ogromną ilość danych generowanych za pomocą tej technologii niezbędna jest późniejsza analiza bioinformatyczna i statystyczna. Analiza bioinformatyczna będzie taka sama, jak wspomniano wcześniej dla innych próbek biologicznych.

Wszystkie metody analityczne zostaną odpowiednio zaktualizowane zgodnie z najnowocześniejszą metodologią.

Przechowywanie próbek Wszystkie próbki matczyne zostaną niezwłocznie pobrane przez badacza i zamrożone na miejscu w temperaturze -20°C do czasu ich przetransportowania do laboratorium znajdującego się poza terenem zakładu w firmie APC Microbiome Ireland w celu jak najszybszego przetworzenia i zamrożenia w celu przechowywania.

Wszystkie próbki noworodków pobrane na OIOM-ie dla noworodków będą przechowywane w zamrażarce badawczej, dopóki nie będą mogły zostać przetransportowane do zewnętrznego laboratorium w firmie APC Microbiome Ireland w celu jak najszybszego przetworzenia i zamrożenia w celu przechowywania.

Analiza bioinformatyczna Analiza bioinformatyczna będzie obejmowała następujące odczyty sparowanych końcówek o długości 300 bp zostaną zebrane przy użyciu FLASH, a zestaw narzędzi QIIME zostanie wykorzystany do dalszego przetwarzania odczytów sparowanych końcówek, w tym filtrowania jakości i usuwania niedopasowanych kodów kreskowych i sekwencji poniżej długości progi. Sekwencje OTU zostaną wyrównane przy użyciu PyNAST, a baza danych SILVA SSUREf zostanie wykorzystana do określenia taksonomii. Różnorodność alfa i beta zostanie obliczona przy użyciu QIIME. Wreszcie wykresy analizy głównych współrzędnych (PCoA) zostaną wykorzystane do wizualizacji różnic w różnorodności beta w oparciu o macierze odległości UniFrac.

Pierwszorzędowy punkt końcowy Pierwszorzędowym punktem końcowym badania będzie 24-miesięczna ocena ostatniego zarejestrowanego uczestnika. Badanie ma na celu włączenie 80-100 niemowląt urodzonych przed 32 tygodniem ciąży w okresie 18 miesięcy. Analizy zostaną przeprowadzone od pierwszych próbek po urodzeniu w celu wykrycia istniejących, wczesnych kolonizatorów jelita niemowlęcia (prawdopodobnie poprzez transmisję pionową) i określenia wzorców osadzania się mikrobiomu u tych wcześniaków.

Procedury regulacyjne i administracyjne Badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z wersją Deklaracji Helsińskiej z 1964 r. z Fortalezy, Brazylia, z października 2013 r. Protokół i ulotka informacyjna dla uczestnika/ICF zostaną zatwierdzone przez Komisję Etyki Badań Klinicznych Szpitali Klinicznych w Cork.

Informacje dla uczestnika/Świadoma zgoda Formularz świadomej zgody wykorzystany w tym badaniu oraz wszelkie zmiany dokonane w trakcie badania zostały przed użyciem zatwierdzone prospektywnie przez Komisję ds. Etyki Badań Klinicznych Szpitali Klinicznych w Cork. Każdy formularz świadomej zgody będzie zawierał wszystkie istotne elementy wymagane obecnie przez wytyczne ICH E6 dotyczące dobrej praktyki klinicznej (GCP) i ustawy o ochronie danych z 1988 i 2003 r. oraz RODO z 25 maja 2018 r.

Uczestnik może w każdej chwili zrezygnować z udziału w badaniu bez żadnych konsekwencji. Ponadto badacz może wycofać uczestników z badania, jeśli leży to w najlepszym interesie uczestnika. Przyczyna wycofania się uczestników z badania zostanie udokumentowana w notatkach uczestników.

GCP i przechowywanie dokumentacji Badanie będzie zarządzane i prowadzone zgodnie z najnowszymi wytycznymi Międzynarodowej Konferencji w sprawie Harmonizacji (ICH) dotyczącymi Dobrej Praktyki Klinicznej (GCP). Badacz będzie wykonywał lub bezpośrednio nadzorował wykonywanie wszystkich usług opisanych w niniejszym dokumencie lub związanych z usługami opisanymi w niniejszym dokumencie, zgodnie z najwyższymi standardami medycznej i klinicznej praktyki badawczej. Wykorzystanie i przechowywanie danych zebranych podczas tego badania będzie zgodne z ogólnym rozporządzeniem o ochronie danych (RODO) (rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) 2016/679) oraz ustawą o ochronie danych z 2018 r. (sekcja 36 ust. 2) ) (Badania zdrowotne) Regulamin 2018.