Establecimiento del microbioma en bebés prematuros (PIMENTO)

El trabajo realizado anteriormente ha identificado varios factores asociados con alteraciones en el microbioma intestinal neonatal. Estos incluyen la edad gestacional, el tipo de parto, la exposición a los antibióticos y la elección de la alimentación. Por lo general, se alienta a las madres de bebés con muy bajo peso al nacer a extraerse leche materna para su bebé. Esto se asocia con tasas más bajas de sepsis y de enterocolitis necrosante. Algunos de estos efectos pueden estar relacionados con las bacterias recibidas en la leche materna de su madre. Las correlaciones entre los cambios en el microbioma intestinal neonatal y la microbiota de la leche con la que están siendo alimentados son limitadas. Además, el efecto de la congelación (es decir, la práctica estándar de almacenamiento de leche materna) en la microbiota de la leche materna no ha sido bien caracterizado. Además, en ausencia de Mother's Own Milk (MOM), es clínicamente apropiado ofrecer Donor Human Milk, donde el proceso adicional de pasteurización también puede afectar las cepas bacterianas presentes en ella y conducir a un patrón alterado de colonización del intestino neonatal.

Este es un estudio observacional prospectivo que evaluará el establecimiento y la evolución del microbioma intestinal de bebés muy prematuros utilizando técnicas de secuenciación de próxima generación. Los datos se analizarán mediante bioinformática para evaluar la transmisión vertical de la madre al bebé en el útero, el establecimiento y la evolución del microbioma del bebé prematuro y evaluar cómo las estrategias de manejo de la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) alteran la composición del microbioma y la recuperación después de las intervenciones. Este trabajo proporcionará información detallada que puede proporcionar la base para el desarrollo de probióticos individualizados para bebés muy prematuros y puede ayudar a desarrollar estrategias de manejo de protección del microbioma para la UCIN.

Proceso de reclutamiento y consentimiento Se abordará a las mujeres embarazadas si existe la posibilidad de parto antes de las 32 semanas de gestación. Se proporcionará un folleto de información para los participantes que detallará el propósito del estudio y lo que se espera de los participantes. El estudio también será explicado por un investigador. Se responderán las preguntas y se dará tiempo suficiente para la deliberación. Si desean participar con su bebé, los participantes supuestamente elegibles deben firmar el formulario de consentimiento informado (ICF). Recibirán una copia del formulario de consentimiento firmado. Se permitirá el consentimiento diferido, pero las muestras de bebés recolectadas se almacenarán en el sitio y no se procesarán antes de obtener el consentimiento. Si se rechaza el consentimiento, las muestras recolectadas se descartarán de inmediato.

Los criterios de inclusión/exclusión se evaluarán en todos los puntos de tiempo desde la selección hasta el consentimiento informado hasta el parto del bebé. Los participantes pueden retirarse del estudio si se cumplen los criterios de exclusión después del nacimiento. Para los criterios de inclusión/exclusión, consulte las Secciones 4.1/4.2. Los nacimientos múltiples se inscribirán por separado. Se recolectarán muestras de cada bebé, pero solo se recolectará un conjunto de muestras maternas. En el caso de que un gemelo nazca por vía vaginal y el otro por cesárea, tanto la piel como los hisopos vaginales se recolectarán de la madre, si es posible.

Se recopilará información de los participantes sobre datos demográficos, parto, auxología, alimentación, antibióticos y comorbilidades. Además, se realizará una escala Bayley de desarrollo de bebés y niños pequeños a los 2 años de edad para evaluar el desarrollo neurológico.

Coleccion de muestra

Muestras infantiles

Muestras de heces y meconio La toma de muestras de heces se realizará en la camilla. Los frotis rectales, realizados por la enfermera clínica de admisión, se toman de forma rutinaria al ingreso a la UCIN. En este momento, se tomará un hisopo adicional para el análisis del microbioma. Durante la admisión neonatal, se recolectará una muestra del primer meconio expulsado del pañal y, posteriormente, se tomarán muestras de heces del pañal del bebé cada dos semanas, si es posible, durante los cuidados de rutina.

Orina infantil Durante la estadía como paciente hospitalizado, la enfermera neonatal recolectará la orina semanalmente colocando una almohadilla/hisopos estériles en el pañal del bebé que luego se retirará en la próxima vez que se realicen los cuidados de rutina.

Sangre infantil Las muestras de sangre se recogerán únicamente en el momento de la venopunción por un motivo clínicamente indicado. La venopunción y la toma de muestras serán realizadas por el equipo clínico. No se recolectará más del 1 % del volumen sanguíneo total estimado (eTBV) de un bebé (80 ml/kg) en un momento determinado con fines de investigación (eTBV = 80 ml/kg). Los puntos de tiempo para la recolección de muestras de sangre serán dentro de la primera semana de vida (es decir, antes del establecimiento de la alimentación), entre las 2 y 4 semanas de vida (es decir, una vez que la alimentación enteral se ha establecido por completo), y antes del alta. No se permitirá la venopunción con el único propósito de recolectar una muestra de investigación.

Muestras maternas

Hisopos orales Las muestras orales serán recolectadas por la enfermera/investigadora de investigación tan pronto como sea posible después del nacimiento de la madre utilizando un hisopo estéril.

Hisopado vaginal (Partos vaginales) La partera u obstetra a cargo recogerá un hisopo vaginal de la madre en la sala de partos, o la propia madre en la sala de posparto.

Muestra de piel (partos por cesárea) La enfermera/investigadora de investigación obtendrá una muestra de piel de la madre después del parto. Se recogerá de la parte interna de la muñeca debajo de la muñequera del hospital del participante.

Muestras de heces maternas Los participantes recibirán kits e instrucciones para recolectar muestras de heces. Las muestras se congelarán tan pronto como sean proporcionadas y recolectadas por el equipo de investigación.

Leche materna Se recolectarán muestras de leche materna de MOM de las madres durante todo el estudio. Se les pedirá a las madres que proporcionen una muestra de leche materna de 5 a 15 ml (si es posible) cada dos semanas mientras su bebé esté en la UCIN si tiene un suministro adecuado.

Análisis de muestra

Análisis de heces infantiles Se examinará el cribado de alto rendimiento del ADN metagenómico expresado heterólogamente como un medio para observar la funcionalidad, p. capacidad general para metabolizar ciertas fuentes de carbohidratos (es decir, la leche materna). El ADN se extraerá de las heces de todos los bebés, seguido de la generación de amplicones de PCR utilizando cebadores universales de ARN 16s, purificación y cuantificación de productos de PCR. A continuación, se llevará a cabo la secuenciación de Illumina Miseq en fragmentos de genes de ARNr 16S por individuo. Debido a la gran cantidad de datos que se generan a partir de esta tecnología, el posterior análisis bioinformático y estadístico es fundamental.

El análisis de orina infantil Los ensayos de LC-MS no dirigidos se realizarán con un espectrómetro de masas Orbitrap híbrido con trampa de iones lineal con transformada de Fourier (LTQ FT). El portal en línea de XCMS (https://xcmsonline.scripps.edu/) se utilizará para el procesamiento de datos (alineación, selección de picos, reintegraciones de pico cero, agrupación de características y evaluación de muestras de control de calidad). Para anotar compuestos, se utilizará una estrategia de selección basada en las características más abundantes y estadísticamente significativas. Para ayudar a la identificación de metabolitos, se realizará un análisis de agrupación adicional utilizando el análisis de correlación de Spearman.

Análisis de sangre infantil Las muestras de sangre se examinarán en relación con la metabolómica funcional, incluidos, entre otros, el análisis mediante metabolómica de escopeta y la comparación con los conjuntos de datos de alto rendimiento del microbioma de las heces al mismo tiempo en busca de relaciones con grupos de señalización microbianos conocidos.

Análisis de muestras maternas Se analizará la composición microbiana periparto oral, vaginal y de la piel, junto con datos clínicos y demográficos generales. Se realizará una comparación entre los perfiles de la microbiota materna con estudios previos y los datos se examinarán con los datos del microbioma intestinal infantil temprano para evaluar la transferencia vertical y horizontal de microorganismos en la transmisión maternoinfantil. El ADN se extraerá de las muestras, seguido de la generación de amplicones de PCR utilizando cebadores de ARN 16s universales, purificación y cuantificación de productos de PCR. A continuación, se llevará a cabo la secuenciación de Illumina Miseq en fragmentos de genes de ARNr 16S por individuo. Debido a la gran cantidad de datos que se generan a partir de esta tecnología, el posterior análisis bioinformático y estadístico es fundamental.

Los investigadores analizarán la composición de la microbiota de las heces para determinar su contenido microbiano utilizando métodos de última generación, que posiblemente incluyan, entre otros, la secuenciación y la PCR cuantitativa.

Los investigadores analizarán la composición microbiana fecal materna y el metagenoma microbiano fecal, junto con datos clínicos y demográficos generales. Las secuencias de composición microbiana fecal revelarán qué tipos de bacterias están presentes y los análisis metagenómicos indicarán el potencial metabólico de la carga microbiana. Proponemos utilizar un cribado de alto rendimiento de ADN metagenómico expresado heterólogamente como un medio para observar la funcionalidad de diferentes poblaciones, p. capacidad general para metabolizar ciertas fuentes de carbohidratos, transformación de toxinas, etc. El ADN se extraerá de las heces maternas como se describe para las heces del bebé.

Análisis de la leche materna Los investigadores analizarán la composición microbiana de la leche y el metagenoma microbiano, junto con datos clínicos y demográficos generales. Los perfiles bacterianos se compararán con estudios previos informados sobre el microbioma intestinal materno y se correlacionarán los datos con los datos del microbioma de heces infantiles para evaluar la transferencia horizontal de microorganismos en la transmisión maternoinfantil. Se utilizará un cribado de alto rendimiento de ADN metagenómico expresado heterólogamente como un medio para observar la funcionalidad, p. capacidad general para metabolizar ciertas fuentes de carbohidratos (p. oligosacáridos de la leche humana). El ADN se extraerá de la leche materna de todos los sujetos, seguido de la generación de amplicones de PCR utilizando cebadores universales de ARN 16s, purificación y cuantificación de productos de PCR. A continuación, se llevará a cabo la secuenciación de Illumina Miseq en fragmentos de genes de ARNr 16S por individuo. Los bacteriófagos son importantes reguladores de la composición del microbioma y desempeñan un papel clave en el mantenimiento del equilibrio adecuado del ecosistema lácteo entre el depredador y la presa. El bacteriófago se aislará de la leche humana para fines de secuenciación metagenómica independiente de la secuencia. Los bacteriófagos asociados con las inmunoglobulinas se aislarán y secuenciarán de manera similar. Debido a la gran cantidad de datos que se generan a partir de esta tecnología, el posterior análisis bioinformático y estadístico es fundamental. El análisis bioinformático será el mismo que el mencionado anteriormente para el resto de muestras biológicas.

Todos los métodos analíticos se actualizarán según corresponda de acuerdo con la metodología más avanzada.

Almacenamiento de muestras El investigador recolectará inmediatamente todas las muestras maternas y las congelará en el sitio a -20 °C hasta que puedan transportarse al laboratorio externo en APC Microbiome Ireland para procesarlas lo antes posible y congelarlas para su almacenamiento.

Todas las muestras de bebés obtenidas en la NICU se almacenarán en el congelador de investigación hasta que puedan transportarse al laboratorio externo en APC Microbiome Ireland para procesarlas lo antes posible y congelarlas para su almacenamiento.

Análisis bioinformático El análisis bioinformático implicará lo siguiente: se ensamblarán lecturas de extremos emparejados de 300 pb mediante FLASH y se usará el conjunto de herramientas QIIME para el procesamiento posterior de lecturas de extremos emparejados, incluido el filtrado de calidad y la eliminación de códigos de barras que no coinciden y secuencias por debajo de la longitud umbrales Las secuencias de OTU se alinearán utilizando PyNAST y la base de datos SILVA SSURef se utilizará para determinar la taxonomía. Las diversidades alfa y beta se calcularán utilizando QIIME. Finalmente, se utilizarán gráficos de análisis de coordenadas principales (PCoA) para visualizar las diferencias en la diversidad beta en función de las matrices de distancia UniFrac.

Criterio de valoración principal El criterio de valoración principal del estudio será la evaluación de 24 meses del último participante inscrito. El estudio tiene como objetivo inscribir de 80 a 100 bebés nacidos antes de las 32 semanas de gestación durante un período de 18 meses. Los análisis se realizarán a partir de las primeras muestras después del nacimiento para detectar colonizadores tempranos existentes en el intestino del bebé (probablemente a través de la transmisión vertical) y determinar los patrones de establecimiento del microbioma en estos bebés prematuros.

Procedimientos regulatorios y administrativos El estudio se realizará de acuerdo con la versión Fortaleza, Brasil, octubre de 2013 de la Declaración de Helsinki de 1964. El Protocolo y el Folleto de información para el participante/ICF serán aprobados por el Comité de Ética de Investigación Clínica de los Hospitales Docentes de Cork.

Información del participante/Consentimiento informado El formulario de consentimiento informado utilizado en este estudio, y cualquier cambio realizado durante el estudio, han sido aprobados prospectivamente por el Comité Ético de Investigación Clínica de los Hospitales Docentes de Cork antes de su uso. Cada formulario de consentimiento informado incluirá todos los elementos relevantes actualmente requeridos por la Directriz ICH E6 para Buenas Prácticas Clínicas (GCP) y la Ley de Protección de Datos de 1988 y 2003, y GDPR del 25 de mayo de 2018.

Los participantes pueden retirarse de la participación en el estudio en cualquier momento sin perjuicio. Además, el investigador puede retirar a los participantes del estudio si es en el mejor interés del participante. El motivo de los retiros de los participantes del estudio se documentará en las notas del caso de los participantes.

GCP y retención de registros El estudio se administrará y realizará de acuerdo con las últimas pautas de la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) para Buenas Prácticas Clínicas (GCP). El investigador realizará o supervisará directamente el desempeño de todos los servicios descritos en este documento, o relacionados con los descritos en este documento, de acuerdo con los más altos estándares de práctica de investigación médica y clínica. El uso y almacenamiento de los datos recopilados durante este estudio cumplirá con el Reglamento General de Protección de Datos (RGPD) (Reglamento (UE) 2016/679 del Parlamento Europeo y del Consejo) y la Ley de Protección de Datos de 2018 (Sección 36(2) ) (Investigación en Salud) Reglamento 2018.