Microbioom-vestiging bij te vroeg geboren baby's (PIMENTO)

Eerder uitgevoerd werk heeft verschillende factoren geïdentificeerd die verband houden met veranderingen in het neonatale darmmicrobioom. Deze omvatten zwangerschapsduur, wijze van bevalling, blootstelling aan antibiotica en voedingskeuze. Moeders van baby's met een zeer laag geboortegewicht worden doorgaans aangemoedigd om moedermelk voor hun baby af te kolven. Dit gaat gepaard met lagere percentages sepsis en necrotiserende enterocolitis. Sommige van deze effecten kunnen verband houden met de bacteriën die ze van hun moeder in de moedermelk hebben gekregen. Correlaties tussen veranderingen in het neonatale darmmicrobioom en de microbiota van de melk die ze krijgen, zijn beperkt. Bovendien is het effect van bevriezing (d.w.z. de standaardpraktijk voor het bewaren van moedermelk) op de microbiota van moedermelk niet goed gekarakteriseerd. Bovendien is het bij afwezigheid van moedermelk (MOM) klinisch aangewezen om donormelk aan te bieden, waarbij het aanvullende pasteurisatieproces ook de daarin aanwezige bacteriestammen kan aantasten en kan leiden tot een veranderd patroon van kolonisatie van de neonatale darm.

Dit is een prospectieve observationele studie die de totstandkoming en evolutie van het darmmicrobioom van zeer premature baby's zal evalueren met behulp van sequencing-technieken van de volgende generatie. Gegevens zullen worden geanalyseerd met behulp van bio-informatica om de verticale overdracht van moeder op baby in utero, de vestiging en evolutie van het microbioom van premature baby's te beoordelen en te evalueren hoe beheersstrategieën van de Neonatale Intensive Care Unit (NICU) de samenstelling van het microbioom en het herstel na interventies veranderen. Dit werk zal gedetailleerde informatie opleveren die de basis kan vormen voor de ontwikkeling van geïndividualiseerde probiotica voor zeer premature baby's en kan helpen bij het ontwikkelen van microbioombeschermende managementstrategieën voor de NICU.

Wervings- en toestemmingsproces Zwangere vrouwen worden benaderd als er een mogelijkheid is om vóór 32 weken zwangerschap te bevallen. Er zal een informatiebrochure voor de deelnemers worden verstrekt waarin het doel van het onderzoek wordt beschreven en wat er van de deelnemers wordt verwacht. Ook zal het onderzoek worden toegelicht door een onderzoeker. Vragen worden beantwoord en er wordt voldoende tijd voorzien voor beraadslaging. Als ze willen deelnemen met hun baby, moeten de vermoedelijk in aanmerking komende deelnemers het formulier voor geïnformeerde toestemming (ICF) ondertekenen. Zij ontvangen een kopie van het ondertekende toestemmingsformulier. Uitgestelde toestemming is toegestaan, maar verzamelde babymonsters worden ter plaatse opgeslagen en worden niet verwerkt voordat toestemming is verkregen. Als de toestemming wordt geweigerd, worden alle verzamelde monsters onmiddellijk weggegooid.

Opname-/uitsluitingscriteria zullen op alle tijdstippen worden beoordeeld, van screening tot geïnformeerde toestemming tot de bevalling van het kind. Deelnemers kunnen uit het onderzoek worden teruggetrokken als postnataal aan de uitsluitingscriteria wordt voldaan. Zie paragraaf 4.1/4.2 voor in- en uitsluitingscriteria. Meerlinggeboorten worden apart ingeschreven. Van elk kind worden monsters genomen, maar er wordt slechts één set moedermonsters verzameld. In het geval dat de ene tweeling vaginaal wordt afgeleverd en de andere via een keizersnede, worden indien mogelijk zowel de huid als de vaginale uitstrijkjes bij de moeder afgenomen.

Informatie met betrekking tot demografie, bevalling, auxologie, voeding, antibiotica en comorbiditeit zal bij de deelnemers worden verzameld. Daarnaast zal op de leeftijd van 2 jaar een Bayley-schaal van de ontwikkeling van baby's en peuters worden uitgevoerd om de neurologische ontwikkeling te beoordelen.

Voorbeeldverzameling

Baby monsters

Meconium- en ontlastingsmonsters Het ontlastingsmonster wordt genomen aan het bed. Bij opname op de NICU worden routinematig rectale uitstrijkjes gemaakt door de ziekenhuisverpleegkundige. Op dit moment zal er een extra uitstrijkje worden genomen voor microbioomanalyse. Tijdens de neonatale opname wordt een monster van het eerste gepasseerde meconium uit de luier genomen en daarna wordt, indien mogelijk, tweewekelijks ontlasting uit de luier van het kind genomen tijdens routinematige verzorgingen.

Urine van de baby Tijdens het verblijf in het ziekenhuis wordt de urine wekelijks verzameld door de neonatologieverpleegkundige door een steriel wattenstaafje in de luier van de baby te plaatsen, die bij de volgende routinematige verzorging wordt verwijderd.

Bloed van baby's Bloedmonsters worden alleen afgenomen op het moment van aderpunctie om een ​​klinisch geïndiceerde reden. Aderpunctie en monsterafname zullen worden uitgevoerd door het klinische team. Niet meer dan 1% van het geschatte totale bloedvolume (eTBV) (80 ml/kg) van een baby zal op een bepaald tijdstip worden afgenomen voor onderzoeksdoeleinden (eTBV=80 ml/kg). Tijdstippen voor bloedafname zullen binnen de eerste levensweek zijn (d.w.z. vóór aanvang van de voeding), tussen 2 en 4 levensweken (d.w.z. zodra de enterale voeding volledig tot stand is gebracht), en vóór ontslag. Aderpunctie met als enig doel het verzamelen van een onderzoeksmonster is niet toegestaan.

Moedermonsters

Monduitstrijkjes Orale uitstrijkjes worden door de onderzoeksverpleegkundige/onderzoeker zo snel mogelijk na de geboorte afgenomen bij de moeder met behulp van een steriel uitstrijkje.

Vaginaal uitstrijkje (vaginale bevallingen) Een vaginaal uitstrijkje wordt bij de moeder afgenomen door de behandelend verloskundige of verloskundige in de verloskamer, of door de moeder zelf op de postnatale afdeling.

Huiduitstrijkje (keizersnede bevallingen) Een huiduitstrijkje wordt na de bevalling door de onderzoeksverpleegkundige/onderzoeker bij de moeder afgenomen. Het wordt verzameld aan de binnenkant van de pols onder de ziekenhuispolsband van de deelnemer.

Maternale ontlastingsmonsters De deelnemers krijgen kits en instructies om ontlastingsmonsters te verzamelen. Monsters worden ingevroren zodra ze zijn verstrekt en verzameld door het onderzoeksteam.

Moedermelk Moedermelkmonsters van MOM zullen tijdens het onderzoek bij moeders worden verzameld. Moeders zal worden gevraagd om elke twee weken een monster van 5-15 ml moedermelk te geven (indien mogelijk) terwijl hun baby op de NICU ligt, als ze voldoende voorraad heeft.

Voorbeeldanalyse

Analyse voor kinderontlasting High-throughput screening van heteroloog tot expressie gebracht metagenomisch DNA zal worden onderzocht als een manier om naar de functionaliteit te kijken, b.v. algemeen vermogen om bepaalde koolhydraatbronnen te metaboliseren (d.w.z. moedermelk). DNA zal worden geëxtraheerd uit de ontlasting van alle baby's, gevolgd door het genereren van PCR-amplicons met behulp van universele 16s RNA-primers, zuivering en kwantificering van PCR-producten. Illumina Miseq-sequencing zal dan worden uitgevoerd op 16S rRNA-genenfragmenten per individu. Vanwege de enorme hoeveelheid gegevens die met deze technologie wordt gegenereerd, is daaropvolgende bioinformatica en statistische analyse essentieel.

Analyse voor zuigelingenurine Ongerichte LC-MS-assays zullen worden uitgevoerd met een hybride lineaire ionenval Fourier Transform (LTQ FT) Orbitrap-massaspectrometer. Het XCMS Online-portaal (https://xcmsonline.scripps.edu/) zal worden gebruikt voor gegevensverwerking (uitlijning, piekpicking, nul-piekreïntegraties, groepering van kenmerken en beoordeling van kwaliteitscontrolemonsters). Om verbindingen te annoteren, zal een selectiestrategie worden gebruikt op basis van de meest voorkomende en de meest statistisch significante kenmerken. Om de identificatie van metabolieten te vergemakkelijken, zal een aanvullende clusteranalyse worden uitgevoerd met behulp van Spearman-correlatieanalyse.

Analyse van babybloed Bloedmonsters zullen worden onderzocht in relatie tot functionele metabolomics, inclusief, maar niet beperkt tot, analyse met behulp van shotgun-metabolomics en vergelijking met de datasets van het ontlastingsmicrobioom met hoge doorvoer, terwijl tegelijkertijd wordt gezocht naar relaties met bekende microbiële signaalgroepen.

Analyse van maternale monsters De peri-partum orale, vaginale en huidmicrobiële samenstelling, in combinatie met algemene klinische en demografische gegevens, zal worden geanalyseerd. Er zal een vergelijking worden gemaakt tussen maternale microbiota-profielen met eerdere studies en gegevens zullen worden onderzocht met de gegevens van het darmmicrobioom van de vroege baby om de verticale en horizontale overdracht van micro-organismen bij de overdracht van moeder naar kind te beoordelen. DNA zal worden geëxtraheerd uit monsters, gevolgd door het genereren van PCR-amplicons met behulp van universele 16s RNA-primers, zuivering en kwantificering van PCR-producten. Illumina Miseq-sequencing zal dan worden uitgevoerd op 16S rRNA-genenfragmenten per individu. Vanwege de enorme hoeveelheid gegevens die met deze technologie wordt gegenereerd, is daaropvolgende bioinformatica en statistische analyse essentieel.

De samenstelling van de microbiota van de ontlasting zal door de onderzoekers worden geanalyseerd op hun microbiële inhoud met behulp van geavanceerde methoden, mogelijk inclusief maar niet beperkt tot sequencing en kwantitatieve PCR.

De onderzoekers zullen de maternale fecale microbiële samenstelling en het fecale microbiële metagenoom analyseren in combinatie met algemene klinische en demografische gegevens. Fecale microbiële samenstellingssequenties zullen onthullen welke bacterietypes aanwezig zijn, en metagenomische analyses zullen het metabolische potentieel van de microbiële belasting aangeven. We stellen voor om high-throughput screening van heteroloog tot expressie gebracht metagenomisch DNA te gebruiken als een manier om naar de functionaliteit van verschillende populaties te kijken, b.v. algemeen vermogen om bepaalde koolhydraatbronnen te metaboliseren, transformatie van toxines enz. DNA zal worden geëxtraheerd uit de ontlasting van de moeder, zoals beschreven voor de ontlasting van de baby.

Analyse voor moedermelk De onderzoekers zullen de microbiële samenstelling van melk en het microbiële metagenoom analyseren in combinatie met algemene klinische en demografische gegevens. Bacterieprofielen zullen worden vergeleken met eerdere studies die zijn gerapporteerd over het microbioom van de moederdarm en de gegevens correleren met de gegevens van het microbioom van de ontlasting van de baby om de horizontale overdracht van micro-organismen bij de overdracht van moeder naar kind te beoordelen. High-throughput screening van heteroloog tot expressie gebracht metagenomisch DNA zal worden gebruikt om de functionaliteit te bekijken, b.v. algemeen vermogen om bepaalde koolhydraatbronnen te metaboliseren (bijv. oligosacchariden van moedermelk). DNA zal worden geëxtraheerd uit de moedermelk van alle proefpersonen, gevolgd door het genereren van PCR-amplicons met behulp van universele 16s RNA-primers, zuivering en kwantificering van PCR-producten. Illumina Miseq-sequencing zal dan worden uitgevoerd op 16S rRNA-genenfragmenten per individu. Bacteriofagen zijn belangrijke regulatoren van de samenstelling van het microbioom en spelen een sleutelrol bij het handhaven van het juiste melkecosysteemevenwicht tussen roofdier en prooi. Bacteriofaag zal worden geïsoleerd uit moedermelk met het oog op sequentie-onafhankelijke metagenomische sequencing. Die bacteriofagen geassocieerd met immunoglobulinen zullen op dezelfde manier worden geïsoleerd en gesequenced. Vanwege de enorme hoeveelheid gegevens die met deze technologie wordt gegenereerd, is daaropvolgende bioinformatica en statistische analyse essentieel. Bio-informatica-analyse zal hetzelfde zijn als eerder vermeld voor de andere biologische monsters.

Alle analytische methoden zullen indien nodig worden bijgewerkt in overeenstemming met de modernste methodologie.

Monsteropslag Alle monsters van de moeder worden onmiddellijk door de onderzoeker verzameld en ter plekke ingevroren bij -20°C totdat ze naar het externe laboratorium van APC Microbiome Ireland kunnen worden getransporteerd om zo snel mogelijk te worden verwerkt en ingevroren voor opslag.

Alle babymonsters die in de NICU zijn verkregen, worden in de onderzoeksvriezer bewaard totdat ze naar het externe laboratorium van APC Microbiome Ireland kunnen worden vervoerd om zo snel mogelijk te worden verwerkt en ingevroren voor opslag.

Bio-informatica-analyse Bio-informatica-analyse omvat het volgende: 300 bp paired-end reads worden geassembleerd met behulp van FLASH en de QIIME-toolsuite wordt gebruikt voor de verdere verwerking van paired-end reads, inclusief kwaliteitsfiltering en verwijdering van niet-overeenkomende barcodes en sequenties onder de lengte drempels. OTU-sequenties zullen worden uitgelijnd met behulp van PyNAST en de SILVA SSURef-database zal worden gebruikt om de taxonomie te bepalen. Alfa- en bèta-diversiteiten worden berekend met behulp van QIIME. Ten slotte zullen hoofdcoördinatenanalyse (PCoA) plots worden gebruikt om verschillen in bèta-diversiteit te visualiseren op basis van UniFrac-afstandsmatrices.

Primair eindpunt Het primaire eindpunt van de studie is de 24 maanden durende beoordeling van de laatste ingeschreven deelnemer. Het doel van de studie is om 80 - 100 baby's te rekruteren die vóór een zwangerschapsduur van 32 weken zijn geboren gedurende een periode van 18 maanden. Er zullen analyses worden uitgevoerd vanaf de eerste monsters na de geboorte om bestaande, vroege kolonisatoren van de kinderdarm te detecteren (waarschijnlijk door verticale transmissie) en om patronen van microbioomvorming bij deze te vroeg geboren baby's te bepalen.

Regelgevende en administratieve procedures Het onderzoek zal worden uitgevoerd in overeenstemming met de versie Fortaleza, Brazilië, oktober 2013 van de Verklaring van Helsinki 1964. Het protocol en de bijsluiter/ICF voor deelnemers worden goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van de Cork Teaching Hospitals.

Informatie over de deelnemer/geïnformeerde toestemming Het formulier voor geïnformeerde toestemming dat in dit onderzoek is gebruikt, en eventuele wijzigingen die tijdens het onderzoek zijn aangebracht, zijn vóór gebruik prospectief goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van de Cork Teaching Hospitals. Elk formulier voor geïnformeerde toestemming zal alle relevante elementen bevatten die momenteel vereist zijn door de ICH E6-richtlijn voor goede klinische praktijken (GCP) en de wet op de gegevensbescherming van 1988 en 2003, en de AVG vanaf 25 mei 2018.

Deelnemers kunnen zich op elk moment en zonder nadelige gevolgen terugtrekken uit deelname aan het onderzoek. Bovendien kan de onderzoeker deelnemers uit het onderzoek terugtrekken als dit in het belang van de deelnemer is. De reden voor de terugtrekking van deelnemers uit het onderzoek zal worden gedocumenteerd in de aantekeningen van de deelnemers.

GCP en dossierbewaring Het onderzoek zal worden beheerd en uitgevoerd volgens de laatste richtlijnen van de International Conference on Harmonization (ICH) voor goede klinische praktijken (GCP). De onderzoeker zal de uitvoering van alle hierin beschreven diensten, of in verband met de hierin beschreven diensten, uitvoeren of er rechtstreeks toezicht op houden, in overeenstemming met de hoogste normen van medische en klinische onderzoekspraktijken. Het gebruik en de opslag van gegevens die tijdens dit onderzoek zijn verzameld, zal voldoen aan de Algemene Verordening Gegevensbescherming (AVG) (Verordening (EU) 2016/679 van het Europees Parlement en de Raad) en de Wet Bescherming Persoonsgegevens 2018 (Artikel 36(2) ) (Gezondheidsonderzoek) Regelgeving 2018.