Estabelecimento do microbioma em bebês prematuros (PIMENTO)

O trabalho realizado anteriormente identificou vários fatores associados a alterações no microbioma intestinal neonatal. Estes incluem a idade gestacional, o tipo de parto, a exposição a antibióticos e a escolha da alimentação. As mães de bebês com muito baixo peso ao nascer são normalmente encorajadas a extrair o leite materno para o bebê. Isso está associado a taxas mais baixas de sepse e de enterocolite necrosante. Alguns desses efeitos podem estar relacionados às bactérias recebidas no leite materno de sua mãe. As correlações entre as mudanças no microbioma intestinal neonatal e a microbiota do leite que estão sendo alimentados são limitadas. Além disso, o efeito do congelamento (ou seja, prática padrão de armazenamento do leite materno) na microbiota do leite materno não foi bem caracterizado. Além disso, na ausência do próprio Leite Materno (MOM) é clinicamente adequado oferecer Leite Humano Doado, onde o processo adicional de pasteurização também pode afetar as cepas bacterianas ali presentes e levar a um padrão alterado de colonização do intestino neonatal.

Este é um estudo observacional prospectivo que avaliará o estabelecimento e a evolução do microbioma intestinal de bebês muito prematuros usando técnicas de sequenciamento de última geração. Os dados serão analisados ​​usando bioinformática para avaliar a transmissão vertical de mãe para filho no útero, estabelecimento e evolução do microbioma do bebê prematuro e avaliar como as estratégias de gerenciamento da Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) alteram a composição do microbioma e a recuperação após as intervenções. Este trabalho fornecerá informações detalhadas que podem fornecer a base para o desenvolvimento de probióticos individualizados para bebês muito prematuros e podem ajudar a desenvolver estratégias de gerenciamento de proteção do microbioma para a UTIN.

Recrutamento e processo de consentimento As mulheres grávidas serão abordadas se houver possibilidade de parto antes de 32 semanas de gestação. Será fornecido um folheto informativo aos participantes, que detalhará o objetivo do estudo e o que se espera dos participantes. O estudo também será explicado por um pesquisador. Perguntas serão respondidas e tempo suficiente para deliberação será fornecido. Se desejarem participar com seu bebê, os participantes supostamente elegíveis devem assinar o formulário de consentimento informado (TCLE). Eles receberão uma cópia do formulário de consentimento assinado. O consentimento diferido será permitido, mas quaisquer amostras infantis coletadas serão armazenadas no local e não serão processadas antes da obtenção do consentimento. Se o consentimento for recusado, quaisquer amostras coletadas serão descartadas imediatamente.

Os critérios de inclusão/exclusão serão avaliados em todos os momentos, desde a triagem até o consentimento informado e o parto do bebê. Os participantes podem ser retirados do estudo se os critérios de exclusão forem atendidos após o nascimento. Para critérios de inclusão/exclusão, consulte as Seções 4.1/4.2. Nascimentos múltiplos serão registrados separadamente. Amostras serão coletadas de cada bebê, mas apenas um conjunto de amostras maternas será coletado. No caso de um gêmeo nascer de parto vaginal e o outro de cesariana, tanto a pele quanto a amostra vaginal serão coletadas da mãe, se possível.

Informações sobre dados demográficos, parto, auxologia, alimentação, antibióticos e comorbidades serão coletadas dos participantes. Além disso, uma escala Bayley de desenvolvimento de bebês e crianças pequenas será realizada aos 2 anos de idade para avaliar o neurodesenvolvimento.

Coleta de amostras

Amostras infantis

Amostras de mecônio e fezes As amostras de fezes serão realizadas no berço. Os swabs retais, realizados pela enfermeira clínica de admissão, são coletados rotineiramente na admissão na UTIN. Um cotonete adicional será coletado para análise do microbioma neste momento. Durante a internação neonatal, uma amostra do primeiro mecônio eliminado será coletada da fralda e, posteriormente, as fezes serão coletadas da fralda do bebê quinzenalmente, se possível, durante os cuidados de rotina.

Urina infantil Durante a internação, a urina será coletada semanalmente pela enfermeira neonatal, colocando um absorvente estéril na fralda do bebê, que será removido na próxima ocorrência de cuidados de rotina.

Sangue infantil As amostras de sangue serão coletadas apenas no momento da punção venosa por um motivo clinicamente indicado. A punção venosa e a coleta de amostras serão realizadas pela equipe clínica. Não mais do que 1% do volume sanguíneo total estimado de uma criança (eTBV) (80mls/kg) será coletado em qualquer momento para fins de pesquisa (eTBV=80mls/kg). Os pontos de tempo para a coleta de amostras de sangue serão na primeira semana de vida (ou seja, antes do estabelecimento da alimentação), entre 2 e 4 semanas de vida (i.e. uma vez que a alimentação enteral tenha sido totalmente estabelecida) e antes da alta. Não será permitida a punção venosa com o único objetivo de coletar uma amostra de pesquisa.

Amostras Maternas

Cotonetes orais Amostras orais serão coletadas pela enfermeira pesquisadora/investigador o mais rápido possível após o nascimento da mãe usando um cotonete estéril.

Swab vaginal (Partos vaginais) Um swab vaginal será coletado da mãe pela parteira ou obstetra responsável na sala de parto ou pela própria mãe na enfermaria pós-natal.

Cotonete de pele (partos de cesariana) Um esfregaço de pele será obtido da mãe pela enfermeira pesquisadora/investigador após o parto. Será coletado na face interna do pulso sob a pulseira hospitalar do participante.

Amostras de fezes maternas Os participantes receberão kits e instruções para coletar amostras de fezes. As amostras serão congeladas assim que fornecidas e coletadas pela equipe de pesquisa.

Leite materno Amostras de leite materno da MÃE serão coletadas das mães ao longo do estudo. As mães serão solicitadas a fornecer uma amostra de 5-15 ml de leite materno (se possível) a cada duas semanas enquanto o bebê estiver na UTIN, se ela tiver um suprimento adequado.

Análise de amostra

Análise para fezes infantis A triagem de alto rendimento de DNA metagenômico expresso de forma heteróloga será examinada como um meio de observar a funcionalidade, por ex. capacidade geral de metabolizar certas fontes de carboidratos (ou seja, leite materno). O DNA será extraído das fezes de todas as crianças, seguido pela geração de amplicons de PCR usando primers de RNA 16s universais, purificação e quantificação dos produtos de PCR. O sequenciamento do Illumina Miseq será então realizado em fragmentos de genes 16S rRNA por indivíduo. Devido à grande quantidade de dados que são gerados a partir desta tecnologia, análises bioinformáticas e estatísticas subsequentes são essenciais.

A análise para ensaios de LC-MS sem alvo na urina infantil será realizada com um espectrômetro de massa Orbitrap de armadilha de íons linear híbrida (LTQ FT). O portal XCMS Online (https://xcmsonline.scripps.edu/) será usado para processamento de dados (alinhamento, seleção de pico, reintegrações de pico zero, agrupamento de recursos e avaliação de amostras de controle de qualidade). Para anotar os compostos, uma estratégia de seleção será usada com base nas características mais abundantes e estatisticamente significativas. Para auxiliar na identificação dos metabólitos, uma análise de agrupamento adicional será realizada usando a análise de correlação de Spearman.

Análise para sangue infantil Amostras de sangue serão examinadas em relação à metabolômica funcional, incluindo, mas não se limitando a, análise usando metabolômica shotgun e comparação com conjuntos de dados de alto rendimento do microbioma fecal nos mesmos pontos de tempo procurando relações com grupos de sinalização microbiana conhecidos.

Análise de amostras maternas Será analisada a composição microbiana oral, vaginal e cutânea periparto, em conjunto com dados clínicos e demográficos gerais. A comparação será feita entre os perfis da microbiota materna com estudos anteriores e os dados serão examinados com os dados do microbioma intestinal infantil precoce para avaliar a transferência vertical e horizontal de microorganismos na transmissão materno-infantil. O DNA será extraído das amostras, seguido da geração de amplicons de PCR usando primers de RNA 16s universais, purificação e quantificação dos produtos de PCR. O sequenciamento do Illumina Miseq será então realizado em fragmentos de genes 16S rRNA por indivíduo. Devido à grande quantidade de dados que são gerados a partir desta tecnologia, análises bioinformáticas e estatísticas subsequentes são essenciais.

A composição da microbiota fecal será analisada quanto ao seu conteúdo microbiano pelos investigadores usando métodos de ponta, possivelmente incluindo, mas não limitado a, sequenciamento e PCR quantitativo.

Os investigadores analisarão a composição microbiana fecal materna e o metagenoma microbiano fecal, em conjunto com dados clínicos e demográficos gerais. As sequências de composição microbiana fecal revelarão quais tipos de bactérias estão presentes, e as análises metagenômicas indicarão o potencial metabólico da carga microbiana. Propomos usar a triagem de alto rendimento de DNA metagenômico expresso de forma heteróloga como um meio de observar a funcionalidade de diferentes populações, por exemplo, capacidade geral de metabolizar certas fontes de carboidratos, transformação de toxinas, etc. O DNA será extraído das fezes maternas conforme descrito para as fezes infantis.

Análise do leite materno Os investigadores irão analisar a composição microbiana do leite e metagenoma microbiano, em conjunto com dados clínicos e demográficos gerais. Os perfis bacterianos serão comparados com estudos anteriores relatados sobre o microbioma intestinal materno e correlacionarão os dados com os dados do microbioma fecal infantil para avaliar a transferência horizontal de microorganismos na transmissão materno-infantil. A triagem de alto rendimento de DNA metagenômico expresso de forma heteróloga será usada como um meio de observar a funcionalidade, por ex. capacidade geral de metabolizar certas fontes de carboidratos (por exemplo, oligossacarídeos do leite humano). O DNA será extraído do leite materno de todos os indivíduos, seguido da geração de amplicons de PCR usando primers universais de RNA 16s, purificação e quantificação dos produtos de PCR. O sequenciamento do Illumina Miseq será então realizado em fragmentos de genes 16S rRNA por indivíduo. Os bacteriófagos são reguladores importantes da composição do microbioma e desempenham um papel fundamental na manutenção do equilíbrio adequado do ecossistema do leite entre predador e presa. O bacteriófago será isolado do leite humano para fins de sequenciamento metagenômico independente da sequência. Esses bacteriófagos associados a imunoglobulinas serão isolados e sequenciados de forma semelhante. Devido à grande quantidade de dados que são gerados a partir desta tecnologia, análises bioinformáticas e estatísticas subsequentes são essenciais. A análise bioinformática será a mesma mencionada anteriormente para as demais amostras biológicas.

Todos os métodos analíticos serão atualizados conforme apropriado de acordo com a metodologia de ponta.

Armazenamento de amostras Todas as amostras maternas serão coletadas imediatamente pelo pesquisador e congeladas no local a -20°C até que possam ser transportadas para o laboratório externo da APC Microbiome Ireland para processamento o mais rápido possível e congelamento para armazenamento.

Todas as amostras infantis obtidas na UTIN serão armazenadas no freezer de pesquisa até que possam ser transportadas para o laboratório externo da APC Microbiome Ireland para processamento o mais rápido possível e congelamento para armazenamento.

Análise bioinformática A análise bioinformática envolverá o seguinte: leituras pareadas de 300 pb serão montadas usando FLASH e o conjunto de ferramentas QIIME será usado para processamento adicional de leituras pareadas, incluindo filtragem de qualidade e remoção de códigos de barras incompatíveis e sequências abaixo do comprimento limiares. As sequências OTU serão alinhadas usando PyNAST e o banco de dados SILVA SSURef será usado para determinar a taxonomia. As diversidades alfa e beta serão calculadas usando o QIIME. Finalmente, os gráficos de análise de coordenadas principais (PCoA) serão usados ​​para visualizar as diferenças na diversidade beta com base nas matrizes de distância UniFrac.

Ponto final primário O ponto final primário do estudo será a avaliação de 24 meses do último participante inscrito. O estudo visa inscrever 80 - 100 bebês nascidos antes de 32 semanas de gestação durante um período de 18 meses. As análises serão realizadas a partir das primeiras amostras após o nascimento para detectar os primeiros colonizadores existentes do intestino infantil (provavelmente por transmissão vertical) e determinar os padrões de estabelecimento do microbioma nesses bebês prematuros.

Procedimentos Regulatórios e Administrativos O estudo será conduzido de acordo com a versão Fortaleza, Brasil, outubro de 2013 da Declaração de Helsinki 1964. O Protocolo e o Folheto Informativo do Participante/TCLE serão aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica dos Hospitais de Ensino de Cork.

Informação do participante/consentimento informado O formulário de consentimento informado usado neste estudo, e quaisquer alterações feitas durante o estudo, foram aprovados prospectivamente pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica dos Hospitais de Ensino de Cork antes do uso. Cada formulário de consentimento informado incluirá todos os elementos relevantes atualmente exigidos pela Diretriz ICH E6 para Boas Práticas Clínicas (GCP) e Lei de Proteção de Dados de 1988 e 2003, e GDPR de 25 de maio de 2018.

Os participantes podem desistir de participar do estudo a qualquer momento sem nenhum prejuízo. Além disso, o investigador pode retirar os participantes do estudo se for do interesse do participante. O motivo da retirada dos participantes do estudo será documentado nas notas do caso dos participantes.

GCP e retenção de registros O estudo será gerenciado e conduzido de acordo com as diretrizes mais recentes da Conferência Internacional de Harmonização (ICH) para Boas Práticas Clínicas (GCP). O investigador executará ou supervisionará diretamente o desempenho de todos os serviços aqui descritos, ou incidentais aos descritos aqui, de acordo com os mais altos padrões da prática de pesquisa médica e clínica. O uso e o armazenamento dos dados coletados durante este estudo cumprirão o Regulamento Geral de Proteção de Dados (GDPR) (Regulamento (UE) 2016/679 do Parlamento Europeu e do Conselho) e a Lei de Proteção de Dados de 2018 (Seção 36(2) ) (Pesquisa em Saúde) Regulamentos 2018.