Založení mikrobiomu u předčasně narozených dětí (PIMENTO)

Dříve provedená práce identifikovala několik faktorů spojených se změnami v novorozeneckém střevním mikrobiomu. Patří mezi ně gestační věk, způsob porodu, expozice antibiotikům a volba krmení. Matky kojenců s velmi nízkou porodní hmotností jsou obvykle povzbuzovány k odsávání mateřského mléka pro své dítě. To je spojeno s nižším výskytem sepse a nekrotizující enterokolitidy. Některé z těchto účinků mohou souviset s bakteriemi přijatými v mateřském mléce od jejich matky. Korelace mezi změnami ve střevním mikrobiomu novorozenců a mikrobiotou mléka, kterým jsou krmeni, jsou omezené. Navíc účinek zmrazování (tj. standardní praxe skladování mateřského mléka) na mikroflóru mateřského mléka nebyl dobře charakterizován. Kromě toho, v nepřítomnosti mateřského mléka (MOM) je klinicky vhodné nabízet dárcovské lidské mléko, kde další proces pasterizace může také ovlivnit bakteriální kmeny v něm přítomné a vést ke změněnému vzoru kolonizace novorozeneckého střeva.

Toto je prospektivní observační studie, která bude hodnotit ustavení a vývoj střevního mikrobiomu velmi předčasně narozených dětí pomocí technik sekvenování nové generace. Data budou analyzována pomocí bioinformatiky za účelem posouzení vertikálního přenosu z matky na dítě in utero, vzniku a vývoje mikrobiomu předčasně narozených dětí a hodnocení toho, jak strategie řízení jednotky intenzivní péče pro novorozence (NICU) mění složení mikrobiomu a zotavení po intervencích. Tato práce poskytne podrobné informace, které mohou poskytnout základ pro vývoj individualizovaných probiotik pro velmi předčasně narozené děti a mohou pomoci vyvinout strategie ochrany mikrobiomu pro NICU.

Proces náboru a souhlasu Těhotné ženy budou osloveny, pokud existuje možnost porodu před 32. týdnem těhotenství. Účastníkům bude poskytnut informační leták, který bude podrobně popisovat účel studie a co se od účastníků očekává. Studii také vysvětlí výzkumník. Dotazy budou zodpovězeny a bude poskytnut dostatek času na projednání. Pokud se chtějí zúčastnit se svým dítětem, domněle způsobilí účastníci musí podepsat formulář informovaného souhlasu (ICF). Obdrží kopii podepsaného formuláře souhlasu. Odložený souhlas bude povolen, ale jakékoli odebrané vzorky kojenců budou uloženy na místě a nebudou zpracovány před získáním souhlasu. Pokud bude souhlas odmítnut, všechny odebrané vzorky budou okamžitě zlikvidovány.

Kritéria pro zařazení/vyloučení budou hodnocena ve všech časových bodech od screeningu po informovaný souhlas s porodem dítěte. Účastníci mohou být ze studie vyřazeni, pokud jsou postnatálně splněna vylučovací kritéria. Kritéria pro zařazení/vyloučení viz oddíly 4.1/4.2. Vícečetné porody budou zapsány samostatně. Vzorky budou odebrány od každého kojence, ale bude odebrána pouze jedna sada mateřských vzorků. V případě, že se jedno dvojče rodí vaginálně a druhé císařským řezem, budou matce pokud možno odebrány kožní i vaginální výtěry.

Od účastníků budou shromážděny informace týkající se demografie, porodu, auxologie, krmení, antibiotik a komorbidit. Kromě toho bude ve věku 2 let provedena Bayleyova škála vývoje kojenců a batolat, aby se vyhodnotil neurovývoj.

Kolekce vzorků

Vzorky pro kojence

Vzorky mekonia a stolice Odběr vzorků stolice bude proveden na lůžku. Výtěry z konečníku, prováděné přijímající klinickou sestrou, jsou běžně odebírány při příjmu na JIP. V tuto chvíli bude odebrán další tampon pro analýzu mikrobiomu. Při příjmu novorozence bude odebrán vzorek prvního mekonia z plenky a poté bude odebrán vzorek stolice z plenky kojence dvakrát týdně, pokud je to možné, během běžné péče.

Moč kojenců Během pobytu na stacionáři bude novorozenecká sestra shromažďovat moč jednou týdně umístěním sterilní vložky/výtěru do plenky kojence, která bude poté odstraněna při další běžné péči.

Kojenecká krev Vzorky krve budou odebírány pouze v době venepunkce z klinicky indikovaného důvodu. Venepunkci a odběr vzorků provede klinický tým. Pro účely výzkumu nebude v žádném časovém bodě odebráno více než 1 % odhadovaného celkového objemu krve (eTBV) kojence (80 ml/kg) (eTBV=80 ml/kg). Časové body pro odběr vzorků krve budou během prvního týdne života (tj. před zahájením krmení), mezi 2 a 4 týdny života (tj. jakmile je plně zavedena enterální výživa) a před propuštěním. Venepunkce pouze za účelem sběru výzkumného vzorku nebude povolena.

Mateřské vzorky

Ústní výtěry Vzorky z úst odebere výzkumná sestra/zkoušející co nejdříve po porodu od matky pomocí sterilního výtěru.

Vaginální výtěr (vaginální porod) Vaginální výtěr odebere matce ošetřující porodní asistentka nebo porodník na porodním sále, případně sama rodička na porodním oddělení.

Kožní výtěr (Porody císařským řezem) Kožní výtěr obdrží od matky výzkumná sestra/zkoušející po porodu. Bude shromažďován z vnitřní strany zápěstí pod nemocničním náramkem účastníka.

Vzorky mateřské stolice Účastnicím budou poskytnuty soupravy a instrukce k odběru vzorků stolice. Vzorky budou zmrazeny, jakmile je poskytne a odebere výzkumný tým.

Mateřské mléko Vzorky mateřského mléka MOM budou odebírány od matek po celou dobu studie. Matky budou požádány, aby poskytly 5–15 ml vzorku mateřského mléka (pokud je to možné) každé dva týdny, když je jejich dítě na JIP, pokud má dostatečné zásoby.

Analýza vzorku

Analýza stolice kojenců Vysokovýkonný screening heterologně exprimované metagenomické DNA bude zkoumán jako prostředek ke sledování funkčnosti, např. celková schopnost metabolizovat určité zdroje sacharidů (tj. mateřské mléko). DNA bude extrahována ze stolice všech kojenců, následuje generování PCR amplikonů pomocí univerzálních 16s RNA primerů, purifikace a kvantifikace PCR produktů. Sekvenování Illumina Miseq pak bude provedeno na fragmentech genů 16S rRNA na jednotlivce. Vzhledem k obrovskému množství dat, které tato technologie generuje, je nezbytná následná bioinformatická a statistická analýza.

Analýza moči kojenců Necílené LC-MS testy budou provedeny pomocí hybridního lineárního iontového lapače Fourier Transform (LTQ FT) Orbitrap hmotnostního spektrometru. Portál XCMS Online (https://xcmsonline.scripps.edu/) budou použity pro zpracování dat (zarovnání, výběr píku, reintegrace nulových píku, seskupování funkcí a hodnocení vzorků kontroly kvality). Pro anotaci sloučenin bude použita selekční strategie založená na nejhojnějších a statisticky nejvýznamnějších rysech. Pro usnadnění identifikace metabolitů bude provedena další shluková analýza pomocí Spearmanovy korelační analýzy.

Analýza krve kojenců Krevní vzorky budou zkoumány ve vztahu k funkční metabolomice, včetně, ale bez omezení na, analýzy pomocí metabolomiky brokovnice a srovnání s vysoce výkonnými datovými soubory mikrobiomu stolice ve stejných časových bodech při hledání vztahů ke známým mikrobiálním signalizačním skupinám.

Analýza mateřských vzorků Bude analyzováno peripartální orální, vaginální a kožní mikrobiální složení ve spojení s obecnými klinickými a demografickými údaji. Bude provedeno srovnání profilů mateřské mikroflóry s předchozími studiemi a data budou zkoumána s údaji o raném střevním mikrobiomu kojenců za účelem posouzení vertikálního a horizontálního přenosu mikroorganismů při přenosu z matky na kojence. Ze vzorků bude extrahována DNA, následuje generování PCR amplikonů pomocí univerzálních 16s RNA primerů, purifikace a kvantifikace PCR produktů. Sekvenování Illumina Miseq pak bude provedeno na fragmentech genů 16S rRNA na jednotlivce. Vzhledem k obrovskému množství dat, které tato technologie generuje, je nezbytná následná bioinformatická a statistická analýza.

Složení mikrobioty stolice bude analyzováno na jejich mikrobiální obsah výzkumnými pracovníky za použití nejmodernějších metod, které mohou zahrnovat, ale bez omezení, sekvenování a kvantitativní PCR.

Výzkumníci budou analyzovat mateřské fekální mikrobiální složení a fekální mikrobiální metagenom ve spojení s obecnými klinickými a demografickými údaji. Sekvence fekálního mikrobiálního složení odhalí, které typy bakterií jsou přítomny, a metagenomické analýzy ukáží metabolický potenciál mikrobiální zátěže. Navrhujeme použít vysoce výkonný screening heterologně exprimované metagenomické DNA jako prostředek pro sledování funkčnosti různých populací, např. celková schopnost metabolizovat určité zdroje sacharidů, transformace toxinů atd. DNA bude extrahována z mateřských výkalů, jak je uvedeno pro kojeneckou stolici.

Analýza mateřského mléka Výzkumníci budou analyzovat mikrobiální složení mléka a mikrobiální metagenom ve spojení s obecnými klinickými a demografickými údaji. Bakteriální profily budou porovnány s předchozími studiemi o mateřském střevním mikrobiomu a budou korelovány údaje s údaji o mikrobiomu novorozenecké stolice, aby bylo možné posoudit horizontální přenos mikroorganismů při přenosu z matky na kojence. Vysoce výkonný screening heterologně exprimované metagenomické DNA bude použit jako prostředek pro sledování funkčnosti, např. celková schopnost metabolizovat určité zdroje sacharidů (např. oligosacharidy lidského mléka). DNA bude extrahována z mateřského mléka všech subjektů, následuje generování PCR amplikonů pomocí univerzálních 16s RNA primerů, purifikace a kvantifikace PCR produktů. Sekvenování Illumina Miseq pak bude provedeno na fragmentech genů 16S rRNA na jednotlivce. Bakteriofágy jsou důležitými regulátory složení mikrobiomu a hrají klíčovou roli při udržování vhodné rovnováhy mléčného ekosystému mezi predátorem a kořistí. Bakteriofág bude izolován z lidského mléka pro účely sekvenčně nezávislého metagenomového sekvenování. Ty bakteriofágy spojené s imunoglobuliny budou podobně izolovány a sekvenovány. Vzhledem k obrovskému množství dat, které tato technologie generuje, je nezbytná následná bioinformatická a statistická analýza. Bioinformatická analýza bude stejná, jak bylo uvedeno výše pro ostatní biologické vzorky.

Všechny analytické metody budou podle potřeby aktualizovány v souladu s nejmodernější metodikou.

Skladování vzorků Výzkumník okamžitě odebere všechny mateřské vzorky a zmrazí je na místě při -20 °C, dokud je nebude možné převézt do externí laboratoře v APC Microbiome Ireland, kde je co nejdříve zpracovat a zmrazit pro uskladnění.

Všechny kojenecké vzorky získané na NICU budou uloženy ve výzkumném mrazáku, dokud nebudou moci být převezeny do externí laboratoře v APC Microbiome Ireland ke zpracování co nejdříve a zmrazení pro uskladnění.

Bioinformatická analýza Bioinformatická analýza bude zahrnovat následující, 300 bp párové čtení bude sestaveno pomocí FLASH a sada nástrojů QIIME bude použita pro další zpracování párových koncových čtení, včetně kvalitního filtrování a odstranění neshodných čárových kódů a sekvencí pod délkou prahy. Sekvence OTU budou zarovnány pomocí PyNAST a pro určení taxonomie bude použita databáze SILVA SSURef. Alfa a beta diverzity budou vypočítány pomocí QIIME. Nakonec budou grafy základní souřadnicové analýzy (PCoA) použity k vizualizaci rozdílů v diverzitě beta na základě matic vzdáleností UniFrac.

Primární koncový bod Primárním koncovým bodem studie bude 24měsíční hodnocení posledního přihlášeného účastníka. Cílem studie je zapsat 80 - 100 kojenců narozených před 32. týdnem těhotenství po dobu 18 měsíců. Analýzy budou provedeny z prvních vzorků po narození, aby se detekovaly stávající rané kolonizátory střeva kojenců (pravděpodobně prostřednictvím vertikálního přenosu) a určily se vzorce usazování mikrobiomu u těchto předčasně narozených dětí.

Regulační a administrativní postupy Studie bude provedena v souladu s verzí Fortaleza, Brazílie, říjen 2013 Helsinské deklarace z roku 1964. Protokol a Informační leták/ICF pro účastníky budou schváleny Etickou komisí klinického výzkumu Fakultních nemocnic Cork.

Informace pro účastníky/Informovaný souhlas Formulář informovaného souhlasu použitý v této studii a jakékoli změny provedené během studie byly před použitím prospektivně schváleny Etickou komisí klinického výzkumu Cork Teaching Hospitals. Každý formulář informovaného souhlasu bude obsahovat všechny relevantní prvky, které v současnosti vyžaduje směrnice ICH E6 pro správnou klinickou praxi (GCP) a zákon o ochraně dat z roku 1988 a 2003 a GDPR od 25. května 2018.

Účastníci mohou z účasti ve studii kdykoli bez újmy odstoupit. Kromě toho může zkoušející odvolat účastníky ze studie, pokud je to v nejlepším zájmu účastníka. Důvod odhlášení účastníka ze studie bude zdokumentován v poznámkách účastníků.

GCP a uchovávání záznamů Studie bude řízena a vedena v souladu s nejnovějšími pokyny Mezinárodní konference o harmonizaci (ICH) pro správnou klinickou praxi (GCP). Vyšetřovatel bude provádět nebo přímo dohlížet na výkon všech služeb zde popsaných nebo souvisejících se službami zde popsanými v souladu s nejvyššími standardy lékařské a klinické výzkumné praxe. Používání a uchovávání údajů shromážděných během této studie bude v souladu s obecným nařízením o ochraně osobních údajů (GDPR) (nařízení Evropského parlamentu a Rady (EU) 2016/679) a zákonem o ochraně osobních údajů z roku 2018 (čl. 36 odst. 2) ) (Health Research) Regulations 2018.