Становление микробиома у недоношенных детей (PIMENTO)

Ранее проведенная работа выявила несколько факторов, связанных с изменениями микробиома кишечника новорожденных. К ним относятся гестационный возраст, способ родоразрешения, воздействие антибиотиков и выбор кормления. Матерям младенцев с очень низкой массой тела при рождении обычно рекомендуется сцеживать грудное молоко для своего ребенка. Это связано с меньшей частотой сепсиса и некротизирующего энтероколита. Некоторые из этих эффектов могут быть связаны с бактериями, попавшими в грудное молоко от их матери. Корреляция между изменениями микробиома кишечника новорожденных и микробиотой молока, которым они питаются, ограничена. Более того, влияние замораживания (т. е. стандартная практика хранения грудного молока) на микробиоту грудного молока недостаточно изучено. Кроме того, при отсутствии собственного молока матери (МОМ) клинически целесообразно предлагать донорское человеческое молоко, где дополнительный процесс пастеризации может также повлиять на присутствующие в нем бактериальные штаммы и привести к измененному характеру колонизации кишечника новорожденного.

Это проспективное обсервационное исследование, в котором будет оцениваться формирование и эволюция кишечного микробиома глубоко недоношенных детей с использованием методов секвенирования следующего поколения. Данные будут проанализированы с использованием биоинформатики для оценки вертикальной передачи от матери к ребенку внутриутробно, формирования и эволюции микробиома недоношенного ребенка и оценки того, как стратегии управления отделениями интенсивной терапии новорожденных (ОИТН) изменяют состав микробиома и восстановление после вмешательств. Эта работа предоставит подробную информацию, которая может послужить основой для разработки индивидуализированных пробиотиков для глубоко недоношенных детей и может помочь разработать стратегии защиты микробиома для отделения интенсивной терапии.

Процесс найма и получения согласия Беременные женщины будут сближены, если есть возможность родов до 32 недель беременности. Участникам будет предоставлен информационный буклет, в котором будет подробно описана цель исследования и что ожидается от участников. Исследование также будет объяснено исследователем. На вопросы будут даны ответы, и будет предоставлено достаточное время для обсуждения. Если они хотят участвовать со своим младенцем, предполагаемые подходящие участники должны подписать форму информированного согласия (ICF). Они получат копию подписанной формы согласия. Отложенное согласие будет разрешено, но любые образцы, взятые у младенцев, будут храниться на месте и не будут обрабатываться до получения согласия. Если согласие отклонено, любые собранные образцы будут немедленно утилизированы.

Критерии включения/исключения будут оцениваться на всех этапах от скрининга до информированного согласия на роды. Участники могут быть исключены из исследования, если критерии исключения соблюдены постнатально. Критерии включения/исключения см. в разделах 4.1/4.2. Множественные рождения регистрируются отдельно. Образцы будут взяты у каждого младенца, но будет взят только один набор материнских образцов. В случае, если один близнец рождается вагинально, а другой путем кесарева сечения, по возможности у матери берут мазки с кожи и из влагалища.

Информация о демографии, родах, ауксологии, кормлении, антибиотиках и сопутствующих заболеваниях будет получена от участников. Кроме того, в возрасте 2 лет будет проводиться шкала развития младенцев и малышей Бейли для оценки развития нервной системы.

Сбор образцов

Образцы для младенцев

Образцы мекония и кала. Взятие образцов кала будет проводиться в кроватке. Ректальные мазки, проводимые приемной клинической медсестрой, обычно берутся при поступлении в отделение интенсивной терапии. В это время будет взят дополнительный мазок для анализа микробиома. Во время госпитализации новорожденного образец первого выделенного мекония будет собираться из подгузника, а затем образец стула будет браться из подгузника младенца раз в две недели, если это возможно, во время обычного ухода.

Моча младенца Во время пребывания в стационаре медсестра, работающая с новорожденным, будет еженедельно собирать мочу, помещая стерильную прокладку/тампоны в подгузник младенца, которые затем удаляются при следующем проведении плановых процедур.

Кровь младенцев Образцы крови будут собираться только во время венепункции по клинически показанной причине. Венепункция и сбор образцов будут проводиться клинической бригадой. В любой момент времени для исследовательских целей будет собрано не более 1% предполагаемого общего объема крови младенца (eTBV) (80 мл/кг) (eTBV=80 мл/кг). Сроки сбора образцов крови будут в пределах первой недели жизни (т.е. до начала кормления), между 2 и 4 неделями жизни (т.е. после полного установления энтерального питания) и до выписки. Венепункция с единственной целью сбора образца для исследования запрещена.

Материнские образцы

Мазки из полости рта Образцы из полости рта будут взяты исследовательской медсестрой/исследователем как можно скорее после рождения у матери с помощью стерильного тампона.

Мазок из влагалища (вагинальные роды) Мазок из влагалища берется у матери лечащей акушеркой или акушером в родильном отделении или самой матерью в послеродовом отделении.

Мазок с кожи (кесарево сечение) Мазок с кожи будет взят у матери после родов медсестрой-исследователем/исследователем. Он будет собран с внутренней стороны запястья под больничным браслетом участника.

Образцы материнского стула Участникам будут предоставлены наборы и инструкции по сбору образцов стула. Образцы будут заморожены, как только они будут предоставлены и собраны исследовательской группой.

Грудное молоко Образцы грудного молока MOM будут собираться у матерей на протяжении всего исследования. Матерей попросят сдавать 5-15 мл образца грудного молока (если это возможно) каждые две недели, пока их ребенок находится в отделении интенсивной терапии, если у нее достаточно молока.

Анализ проб

Анализ детского стула Высокопроизводительный скрининг гетерологически экспрессируемой метагеномной ДНК будет рассматриваться как средство изучения функциональности, например. общая способность метаболизировать определенные источники углеводов (т.е. грудное молоко). ДНК будет извлечена из фекалий всех младенцев с последующим созданием ампликонов ПЦР с использованием универсальных 16s РНК-праймеров, очисткой и количественным определением продуктов ПЦР. Затем Illumina Miseq секвенирует фрагменты генов 16S рРНК на человека. Из-за огромного количества данных, которые генерируются с помощью этой технологии, необходим последующий биоинформационный и статистический анализ.

Анализ мочи младенцев Нецелевые анализы ЖХ-МС будут выполняться с помощью гибридного масс-спектрометра Orbitrap с линейной ионной ловушкой и преобразованием Фурье (LTQ FT). Интернет-портал XCMS (https://xcmsonline.scripps.edu/) будет использоваться для обработки данных (выравнивание, выбор пика, повторная интеграция нулевого пика, группировка признаков и оценка образцов контроля качества). Для аннотирования соединений будет использоваться стратегия отбора, основанная на наиболее распространенных и наиболее статистически значимых признаках. Чтобы облегчить идентификацию метаболитов, будет проведен дополнительный кластерный анализ с использованием корреляционного анализа Спирмена.

Анализ крови младенцев Образцы крови будут исследованы в отношении функциональной метаболомики, включая, помимо прочего, анализ с использованием дробовой метаболомики и сравнение с наборами данных высокой пропускной способности микробиома стула в то же время в поисках взаимосвязей с известными микробными сигнальными группами.

Анализ материнских образцов Будет проанализирован перинатальный оральный, вагинальный и кожный микробный состав в сочетании с общими клиническими и демографическими данными. Будет проведено сравнение профилей материнской микробиоты с предыдущими исследованиями, и данные будут изучены с данными микробиома кишечника раннего младенца для оценки вертикального и горизонтального переноса микроорганизмов при передаче инфекции от матери к ребенку. Из образцов будет извлечена ДНК с последующим созданием ампликонов для ПЦР с использованием универсальных 16s РНК-праймеров, очисткой и количественным определением продуктов ПЦР. Затем Illumina Miseq секвенирует фрагменты генов 16S рРНК на человека. Из-за огромного количества данных, которые генерируются с помощью этой технологии, необходим последующий биоинформационный и статистический анализ.

Состав микробиоты стула будет проанализирован исследователями с использованием современных методов, включая, помимо прочего, секвенирование и количественную ПЦР.

Исследователи проанализируют микробный состав материнских фекалий и фекальный микробный метагеном в сочетании с общими клиническими и демографическими данными. Последовательности микробного состава фекалий покажут, какие типы бактерий присутствуют, а метагеномный анализ укажет на метаболический потенциал микробной нагрузки. Мы предлагаем использовать высокопроизводительный скрининг гетерологически экспрессируемой метагеномной ДНК как средство изучения функциональности различных популяций, т.е. общая способность метаболизировать определенные источники углеводов, преобразование токсинов и т. д. ДНК будет извлечена из фекалий матери, как описано для детского стула.

Анализ грудного молока Исследователи проанализируют микробный состав молока и микробный метагеном в сочетании с общими клиническими и демографическими данными. Бактериальные профили будут сравниваться с предыдущими исследованиями микробиома кишечника матери и сопоставлять данные с данными микробиома стула младенцев для оценки горизонтального переноса микроорганизмов при передаче инфекции от матери к ребенку. Высокопроизводительный скрининг гетерологически экспрессируемой метагеномной ДНК будет использоваться как средство изучения функциональности, например. общая способность метаболизировать определенные источники углеводов (например, олигосахариды грудного молока). ДНК будет извлечена из грудного молока всех субъектов с последующим созданием ампликонов ПЦР с использованием универсальных 16s РНК-праймеров, очисткой и количественным определением продуктов ПЦР. Затем Illumina Miseq секвенирует фрагменты генов 16S рРНК на человека. Бактериофаги являются важными регуляторами состава микробиома и играют ключевую роль в поддержании соответствующего равновесия молочной экосистемы между хищником и жертвой. Бактериофаг будет выделен из грудного молока для независимого от последовательности метагеномного секвенирования. Аналогичным образом будут выделены и секвенированы те бактериофаги, которые связаны с иммуноглобулинами. Из-за огромного количества данных, которые генерируются с помощью этой технологии, необходим последующий биоинформационный и статистический анализ. Биоинформационный анализ будет таким же, как упоминалось ранее для других биологических образцов.

Все аналитические методы будут обновляться по мере необходимости в соответствии с самой современной методологией.

Хранение проб Все материнские пробы будут немедленно собраны исследователем и заморожены на месте при температуре -20°C до тех пор, пока их можно будет транспортировать в лабораторию APC Microbiome Ireland за пределами площадки для скорейшей обработки и замораживания для хранения.

Все образцы младенцев, полученные в отделении интенсивной терапии новорожденных, будут храниться в морозильной камере для исследований до тех пор, пока их не можно будет транспортировать в лабораторию APC Microbiome Ireland за пределами площадки для обработки в кратчайшие сроки и замораживания для хранения.

Биоинформатический анализ Биоинформационный анализ будет включать в себя следующее: считывания парных концов длиной 300 п.н. будут собраны с использованием FLASH, а набор инструментов QIIME будет использоваться для дальнейшей обработки считываний парных концов, включая фильтрацию качества и удаление несовпадающих штрих-кодов и последовательностей меньшей длины. пороги. Последовательности OTU будут выравниваться с использованием PyNAST, а база данных SILVA SSURef будет использоваться для определения таксономии. Альфа- и бета-разнообразие будет рассчитано с использованием QIIME. Наконец, графики анализа основных координат (PCoA) будут использоваться для визуализации различий в бета-разнообразии на основе матриц расстояний UniFrac.

Первичная конечная точка Первичной конечной точкой исследования будет 24-месячная оценка последнего зарегистрированного участника. Целью исследования является зачисление 80-100 младенцев, рожденных до 32 недель беременности в течение 18-месячного периода. Анализы будут проводиться из первых образцов после рождения, чтобы обнаружить существующих ранних колонизаторов кишечника младенцев (вероятно, посредством вертикальной передачи) и определить закономерности формирования микробиома у этих недоношенных детей.

Нормативные и административные процедуры Исследование будет проводиться в соответствии с версией Хельсинкской декларации 1964 г., Форталеза, Бразилия, октябрь 2013 г. Протокол и Информационный буклет для участников/ICF будут одобрены Комитетом по этике клинических исследований учебных больниц Корка.

Информация об участнике/Информированное согласие Форма информированного согласия, используемая в этом исследовании, и любые изменения, внесенные в ходе исследования, были проспективно одобрены Комитетом по этике клинических исследований Учебных больниц Корка перед использованием. Каждая форма информированного согласия будет включать все соответствующие элементы, требуемые в настоящее время Руководством ICH E6 по надлежащей клинической практике (GCP) и Законом о защите данных от 1988 и 2003 годов, а также GDPR от 25 мая 2018 года.

Участники могут отказаться от участия в исследовании в любое время без ущерба для себя. Кроме того, исследователь может отозвать участников из исследования, если это отвечает интересам участника. Причина выхода участников из исследования будет задокументирована в примечаниях участников.

GCP и сохранение записей Исследование будет проводиться и управляться в соответствии с последними рекомендациями Международной конференции по гармонизации (ICH) для надлежащей клинической практики (GCP). Исследователь будет выполнять или непосредственно контролировать выполнение всех услуг, описанных в настоящем документе, или сопутствующих услуг, описанных в настоящем документе, в соответствии с самыми высокими стандартами медицинской и клинической исследовательской практики. Использование и хранение данных, собранных в ходе этого исследования, будет соответствовать Общему регламенту о защите данных (GDPR) (Регламент (ЕС) 2016/679 Европейского парламента и Совета) и Закону о защите данных 2018 г. (раздел 36(2)). ) (Медицинские исследования) Правила 2018 г.