Mikrobiometablering hos premature spedbarn (PIMENTO)

Arbeid tidligere har identifisert flere faktorer assosiert med endringer i det neonatale tarmmikrobiomet. Disse inkluderer svangerskapsalder, leveringsmåte, eksponering for antibiotika og fôringsvalg. Mødre til spedbarn med svært lav fødselsvekt oppfordres vanligvis til å ta ut morsmelk til babyen. Dette er assosiert med lavere forekomst av sepsis og nekrotiserende enterokolitt. Noen av disse effektene kan være relatert til bakteriene mottatt i morsmelken fra moren. Korrelasjoner mellom endringer i det neonatale tarmmikrobiomet og mikrobiotaen til melken de får mat er begrenset. Effekten av frysing (dvs. standard oppbevaring av morsmelk) på morsmelkmikrobiota har ikke vært godt karakterisert. Videre, i fravær av Mother's Own Milk (MOM) er det klinisk hensiktsmessig å tilby Donor Human Milk, der den ekstra pasteuriseringsprosessen også kan påvirke bakteriestammene som finnes deri og føre til et endret mønster av kolonisering av neonataltarmen.

Dette er en prospektiv observasjonsstudie som vil evaluere etableringen og utviklingen av tarmmikrobiomet til svært premature spedbarn ved bruk av neste generasjons sekvenseringsteknikker. Data vil bli analysert ved hjelp av bioinformatikk for å vurdere vertikal overføring fra mor til spedbarn in utero, etablering og utvikling av premature spedbarnsmikrobiomet og evaluere hvordan behandlingsstrategier for neonatal intensivavdeling (NICU) endrer mikrobiomets sammensetning og gjenoppretting etter intervensjoner. Dette arbeidet vil gi detaljert informasjon som kan gi grunnlag for utvikling av individualiserte probiotika for svært premature spedbarn og kan bidra til å utvikle mikrobiombeskyttende håndteringsstrategier for NICU.

Rekrutterings- og samtykkeprosess Gravide vil bli kontaktet dersom det er mulighet for fødsel før 32 ukers svangerskap. Et deltakerinformasjonshefte vil bli gitt som beskriver formålet med studien og hva som kan forventes av deltakerne. Studien vil også bli forklart av en forsker. Spørsmål vil bli besvart og tilstrekkelig tid til rådslagning vil bli gitt. Hvis de ønsker å delta med spedbarnet sitt, må de antatt kvalifiserte deltakerne signere skjemaet for informert samtykke (ICF). De vil motta en kopi av det signerte samtykkeskjemaet. Utsatt samtykke vil bli tillatt, men eventuelle spedbarnsprøver som samles inn vil bli lagret på stedet og vil ikke bli behandlet før samtykke er innhentet. Hvis samtykke avslås, vil alle innsamlede prøver bli kastet umiddelbart.

Inkluderings-/eksklusjonskriterier vil bli vurdert på alle tidspunkt fra screening til informert samtykke til fødsel av spedbarnet. Deltakere kan trekkes fra studien dersom eksklusjonskriteriene er oppfylt postnatalt. For inklusjons-/eksklusjonskriterier, se avsnitt 4.1/4.2. Flere fødsler vil bli registrert separat. Prøver vil bli samlet inn fra hvert spedbarn, men bare ett sett med morsprøver vil bli samlet inn. Dersom den ene tvillingen fødes vaginalt og den andre med keisersnitt vil både hud og vaginale vattpinner tas fra moren om mulig.

Informasjon om demografi, levering, auxologi, fôring, antibiotika og komorbiditeter vil bli samlet inn fra deltakerne. I tillegg vil en Bayley-skala for spedbarns- og småbarnsutvikling bli utført ved 2 års alder for å vurdere nevroutvikling.

Prøvesamling

Spedbarnsprøver

Mekonium og avføringsprøver Avføringsprøvetaking vil bli utført på hytta. Rektale vattpinner, utført av innleggende klinisk sykepleier, tas rutinemessig ved innleggelse på NICU. En ekstra vattpinne vil bli tatt for mikrobiomanalyse på dette tidspunktet. Under neonatalinnleggelsen vil en prøve av det første mekoniumet som passeres bli tatt fra bleien, og deretter tas avføring fra babyens bleie annenhver uke, hvis mulig, under rutinemessige pleie.

Spedbarnsurin Under døgnoppholdet samles urinen opp ukentlig av nyfødtsykepleieren ved å legge en steril pute/servietter i spedbarnets bleie som deretter fjernes ved neste gang rutinemessige omsorger forekommer.

Spedbarnsblod Blodprøver vil kun bli tatt på tidspunktet for venepunktur av en klinisk indisert grunn. Venepunktur og prøvetaking vil bli utført av det kliniske teamet. Ikke mer enn 1 % av et spedbarns estimerte totale blodvolum (eTBV) (80 ml/kg) vil bli samlet inn på noe tidspunkt for forskningsformål (eTBV=80 ml/kg). Tidspunkter for blodprøvetaking vil være innen den første uken av livet (dvs. før etablering av fôring), mellom 2 og 4 uker av livet (dvs. når enteral ernæring er fullstendig etablert), og før utskrivning. Venepunksjon med det formål å samle inn en forskningsprøve vil ikke være tillatt.

Morsprøver

Orale vattpinner Muntprøver vil bli samlet inn av forskningssykepleier/etterforsker så snart som mulig etter fødsel fra mor ved hjelp av en steril vattpinne.

Vaginal vattpinne (vaginale forløsninger) Vaginal vattpinne vil bli hentet fra mor av behandlende jordmor eller fødselslege i fødestuen, eller av mor selv på fødselsavdelingen.

Hudpinne (forløsninger ved keisersnitt) En hudpinne vil bli skaffet fra mor av forskningssykepleier/etterforsker etter fødsel. Det vil bli samlet inn fra det indre aspektet av håndleddet under deltakerens sykehusarmbånd.

Avføringsprøver fra mor Deltakerne vil bli utstyrt med sett og instruksjoner for å samle avføringsprøver. Prøver vil bli frosset så snart de er levert og samlet inn av forskerteamet.

Morsmelk Morsmelkprøver av MOM vil bli samlet inn fra mødre gjennom hele studien. Mødre vil bli bedt om å gi en prøve på 5-15 ml morsmelk (hvis mulig) annenhver uke mens spedbarnet er på intensivavdelingen hvis hun har tilstrekkelig forsyning.

Prøveanalyse

Analyse for spedbarnsavføring High-throughput screening av heterologt uttrykt metagenomisk DNA vil bli undersøkt som et middel til å se på funksjonaliteten f.eks. generell evne til å metabolisere visse karbohydratkilder (dvs. morsmelk). DNA vil bli ekstrahert fra avføringen til alle spedbarn etterfulgt av generering av PCR-amplikoner ved bruk av universelle 16s RNA-primere, rensing og kvantifisering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering vil deretter bli utført på 16S rRNA-genfragmenter per individ. På grunn av den enorme mengden data som genereres fra denne teknologien, er påfølgende bioinformatisk og statistisk analyse avgjørende.

Analyse for spedbarnsurin Umålrettede LC-MS-analyser vil bli utført med et hybrid lineært ionefelle Fourier Transform (LTQ FT) Orbitrap massespektrometer. XCMS Online-portalen (https://xcmsonline.scripps.edu/) vil bli brukt til databehandling (justering, toppplukking, null peak-re-integrasjoner, funksjonsgruppering og vurdering av kvalitetskontrollprøver). For å kommentere forbindelser, vil en seleksjonsstrategi bli brukt basert på de mest tallrike og de mest statistisk signifikante egenskapene. For å hjelpe til med identifiseringen av metabolitter, vil en ekstra klyngeanalyse bli utført ved bruk av Spearman-korrelasjonsanalyse.

Analyse for spedbarnsblod Blodprøver vil bli undersøkt i forhold til funksjonell metabolomikk, inkludert, men ikke begrenset til, analyse ved bruk av hagle-metabolomikk og sammenligning med avføringsmikrobiomets høye gjennomstrømningsdatasett på samme tidspunkt for å se etter relasjoner til kjente mikrobielle signalgrupper.

Analyse av morsprøver Den peri-partum orale, vaginale og hudmikrobielle sammensetningen, i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data, vil bli analysert. Sammenligning vil bli gjort mellom mors mikrobiotaprofiler med tidligere studier, og data vil bli undersøkt med tidlig spedbarns tarmmikrobiomdata for å vurdere den vertikale og horisontale overføringen av mikroorganismer i mors-spedbarnsoverføring. DNA vil bli ekstrahert fra prøver, etterfulgt av generering av PCR-amplikoner ved bruk av universelle 16s RNA-primere, rensing og kvantifisering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering vil deretter bli utført på 16S rRNA-genfragmenter per individ. På grunn av den enorme mengden data som genereres fra denne teknologien, er påfølgende bioinformatisk og statistisk analyse avgjørende.

Avføringsmikrobiotasammensetning vil bli analysert for deres mikrobielle innhold av etterforskerne ved å bruke avanserte metoder, muligens inkludert, men ikke begrenset til, sekvensering og kvantitativ PCR.

Etterforskerne vil analysere mors fekale mikrobielle sammensetning og fekale mikrobielle metagenomer, i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data. Fekale mikrobielle sammensetningssekvenser vil avsløre hvilke bakterietyper som finnes, og metagenomiske analyser vil indikere det metabolske potensialet til den mikrobielle belastningen. Vi foreslår å bruke high-throughput screening av heterologt uttrykt metagenomisk DNA som et middel til å se på funksjonaliteten til forskjellige populasjoner, f.eks. generell evne til å metabolisere visse karbohydratkilder, transformasjon av giftstoffer etc. DNA vil bli ekstrahert fra mors avføring som skissert for spedbarns avføring.

Analyse for morsmelk Utforskerne vil analysere melkemikrobielle sammensetning, og mikrobiell metagenom, i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data. Bakterieprofiler vil bli sammenlignet med tidligere studier rapportert på mors tarmmikrobiom og korrelerer dataene med spedbarnsavføringsmikrobiomdata for å vurdere horisontal overføring av mikroorganismer ved mor-spedbarnsoverføring. High-throughput screening av heterologt uttrykt metagenomisk DNA vil bli brukt som et middel til å se på funksjonaliteten f.eks. generell evne til å metabolisere visse karbohydratkilder (f. human melkeoligosakkarider). DNA vil bli ekstrahert fra morsmelk fra alle forsøkspersoner, etterfulgt av generering av PCR-amplikoner ved bruk av universelle 16s RNA-primere, rensing og kvantifisering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering vil deretter bli utført på 16S rRNA-genfragmenter per individ. Bakteriofager er viktige regulatorer av mikrobiomsammensetningen og spiller en nøkkelrolle i å opprettholde den passende melkeøkosystemets likevekt mellom rovdyr og byttedyr. Bakteriofager vil bli isolert fra human melk for formålet med sekvensuavhengig metagenomisk sekvensering. De bakteriofagene som er assosiert med immunglobuliner vil på lignende måte bli isolert og sekvensert. På grunn av den enorme mengden data som genereres fra denne teknologien, er påfølgende bioinformatisk og statistisk analyse avgjørende. Bioinformatisk analyse vil være den samme som nevnt tidligere for de andre biologiske prøvene.

Alle analysemetoder vil bli oppdatert etter behov i henhold til den nyeste metoden.

Prøveoppbevaring Alle morsprøver vil bli samlet umiddelbart av forskeren og frosset på stedet ved -20°C til de kan transporteres til off-site laboratoriet ved APC Microbiome Ireland for behandling så snart som mulig og frysing for lagring.

Alle spedbarnsprøver innhentet i NICU vil bli lagret i forskningsfryseren til de kan transporteres til laboratoriet utenfor stedet ved APC Microbiome Ireland for behandling så snart som mulig og frysing for lagring.

Bioinformatisk analyse Bioinformatisk analyse vil innebære følgende, 300 bp parede endeavlesninger vil bli satt sammen ved hjelp av FLASH og QIIME-pakken med verktøy vil bli brukt til videre prosessering av parede endeavlesninger, inkludert kvalitetsfiltrering og fjerning av mismatchede strekkoder og sekvenser under lengden terskler. OTU-sekvenser vil bli justert ved hjelp av PyNAST og SILVA SSURef-databasen vil bli brukt til å bestemme taksonomi. Alfa- og beta-diversiteter vil bli beregnet ved hjelp av QIIME. Til slutt vil prinsipiell koordinatanalyse (PCoA) plott bli brukt for å visualisere forskjeller i beta-diversitet basert på UniFrac avstandsmatriser.

Primært endepunkt Det primære studieendepunktet vil være 24-månedersvurderingen av den siste deltakeren som ble registrert. Studien tar sikte på å registrere 80 - 100 spedbarn født før 32 ukers svangerskap over en 18-måneders periode. Analyser vil bli utført fra de første prøvene etter fødselen for å oppdage eksisterende, tidlige kolonisatorer av spedbarnets tarm (sannsynligvis gjennom vertikal overføring) og bestemme mønstre for mikrobiometablering hos disse premature spedbarn.

Regulatoriske og administrative prosedyrer Studien vil bli utført i samsvar med versjonen Fortaleza, Brasil, oktober 2013 av Helsinki-erklæringen 1964. Protokollen og deltakerinformasjonsheftet/ICF vil bli godkjent av den kliniske forskningsetiske komiteen ved Cork Teaching Hospitals.

Deltakerinformasjon/Informert samtykke Skjemaet for informert samtykke som brukes i denne studien, og eventuelle endringer som er gjort under studien, har blitt prospektivt godkjent av Clinical Research Ethics Committee ved Cork Teaching Hospitals før bruk. Hvert informert samtykkeskjema vil inneholde alle relevante elementer som for øyeblikket kreves av ICH E6 Guideline for Good Clinical Practice (GCP) og Data Protection Act av 1988 og 2003, og GDPR fra 25. mai 2018.

Deltakerne kan trekke seg fra deltakelsen i studien når som helst uten skade. I tillegg kan etterforskeren trekke deltakere fra studien hvis det er til beste for deltakeren. Årsaken til at deltakeren trekker seg fra studien vil bli dokumentert i deltakernes saksnotater.

GCP og journaloppbevaring Studien vil bli administrert og utført i henhold til de siste retningslinjene for god klinisk praksis (ICH) International Conference on Harmonization (GCP). Etterforskeren vil utføre eller direkte overvåke utførelsen av alle tjenestene som er beskrevet her, eller tilfeldig til de som er beskrevet her, i samsvar med de høyeste standardene for medisinsk og klinisk forskningspraksis. Bruk og lagring av data som samles inn under denne studien vil være i samsvar med den generelle databeskyttelsesforordningen (GDPR) (forordning (EU) 2016/679 fra Europaparlamentet og rådet) og databeskyttelsesloven 2018 (paragraf 36(2) ) (Helseforskning)-forskriften 2018.