早产儿微生物组的建立 (PIMENTO)

之前所做的工作已经确定了与新生儿肠道微生物组改变相关的几个因素。 这些包括胎龄、分娩方式、接触抗生素和喂养选择。 通常鼓励极低出生体重婴儿的母亲为婴儿挤出母乳。 这与较低的败血症和坏死性小肠结肠炎发生率有关。 其中一些影响可能与母乳中的细菌有关。 新生儿肠道微生物群的变化与他们所喂养的母乳微生物群之间的相关性有限。 此外，冷冻（即标准母乳储存做法）对母乳微生物群的影响尚未得到很好的表征。 此外，在没有母乳 (MOM) 的情况下，提供捐赠母乳在临床上是合适的，其中额外的巴氏杀菌过程也可能影响其中存在的细菌菌株，并导致新生儿肠道定植模式改变。

这是一项前瞻性观察性研究，将使用下一代测序技术评估极早产儿肠道微生物组的建立和演变。 将使用生物信息学分析数据，以评估子宫内从母亲到婴儿的垂直传播、早产儿微生物组的建立和演变，并评估新生儿重症监护病房 (NICU) 管理策略如何改变微生物组组成和干预后的恢复。 这项工作将提供详细的信息，这些信息可能为极早产儿个体化益生菌的开发提供基础，并可能有助于制定 NICU 的微生物组保护管理策略。

招募和同意过程 如果有可能在妊娠 32 周之前分娩，将联系孕妇。 将提供参与者信息传单，其中将详细说明研究的目的以及对参与者的期望。 该研究还将由研究人员进行解释。 将回答问题并提供足够的时间进行审议。 如果他们希望与婴儿一起参加，推定合格的参与者必须签署知情同意书 (ICF)。 他们将收到一份已签署的同意书副本。 允许延迟同意，但收集的任何婴儿样本都将在现场存储，在获得同意之前不会进行处理。 如果同意被拒绝，收集的任何样本将被立即丢弃。

将在从筛选到知情同意再到婴儿分娩的所有时间点评估纳入/排除标准。 如果出生后符合排除标准，参与者可能会退出研究。 对于包含/排除标准，请参阅第 4.1/4.2 节。 多胞胎将单独登记。 将从每个婴儿身上采集样本，但只会采集一组母体样本。 如果一对双胞胎通过阴道分娩，另一对通过剖腹产分娩，则将尽可能从母亲那里收集皮肤和阴道拭子。

将从参与者那里收集有关人口统计学、分娩、发育学、喂养、抗生素和合并症的信息。 此外，贝利婴幼儿发育量表将在 2 岁时进行，以评估神经发育。

样品采集

婴儿样品

胎粪和粪便样本 粪便样本将在码头进行。 由入院临床护士执行的直肠拭子在进入 NICU 时常规采集。 此时将采集额外的拭子进行微生物组分析。 在新生儿入院期间，将从尿布中采集第一次排出的胎粪样本，此后如果可能，在常规护理期间每两周从婴儿的尿布中采集粪便样本。

婴儿尿液 在住院期间，新生儿护士将每周收集尿液，方法是将无菌垫/棉签放在婴儿的尿布中，然后在下次进行常规护理时将其取下。

婴儿血液 仅在出于临床指征原因进行静脉穿刺时采集血样。 静脉穿刺和样本采集将由临床团队进行。 出于研究目的（eTBV=80mls/kg），在任何一个时间点采集的婴儿估计总血容量 (eTBV) (80mls/kg) 不超过 1%。 血液样本采集的时间点将在生命的第一周内（即 在建立喂养之前），出生后 2 至 4 周（即 一旦完全建立肠内喂养）和出院前。 不允许仅以收集研究样本为目的的静脉穿刺。

母体样本

口腔拭子 研究护士/调查员将在母亲出生后使用无菌拭子尽快收集口腔样本。

阴道拭子（阴道分娩） 主治助产士或产科医生将在产房采集阴道拭子，或由产妇本人在产后病房采集。

皮肤拭子（剖腹产分娩） 研究护士/调查员将在分娩后从母亲身上获取皮肤拭子。 将从参与者医院手腕带下的手腕内侧收集。

母体粪便样本 将向参与者提供收集粪便样本的工具包和说明。 研究团队提供和收集的样本将立即冷冻。

母乳 MOM 的母乳样本将在整个研究过程中从母亲那里收集。 如果婴儿在新生儿重症监护病房 (NICU) 中供应充足，母亲将被要求每两周提供 5-15 毫升母乳样本（如果可能）。

样品分析

婴儿粪便分析 异源表达的宏基因组 DNA 的高通量筛选将作为查看功能的一种方式进行检查，例如： 代谢某些碳水化合物来源的整体能力（即。 母乳）。 将从所有婴儿的粪便中提取 DNA，然后使用通用 16s RNA 引物生成 PCR 扩增子，对 PCR 产物进行纯化和定量。 然后将对每个个体的 16S rRNA 基因片段进行 Illumina Miseq 测序。 由于该技术产生的数据量巨大，因此后续的生物信息学和统计分析至关重要。

将使用混合线性离子阱傅立叶变换 (LTQ FT) Orbitrap 质谱仪对婴儿尿液进行非靶向 LC-MS 分析。 XCMS 在线门户 (https://xcmsonline.scripps.edu/) 将用于数据处理（对齐、峰值拾取​​、零峰值重新整合、特征分组和质量控制样本评估）。 为了注释化合物，将根据最丰富和最具统计意义的特征使用选择策略。 为了帮助鉴定代谢物，将使用 Spearman 相关分析进行额外的聚类分析。

婴儿血液分析 将检查与功能代谢组学相关的血液样本，包括但不限于使用鸟枪法代谢组学进行分析，并在同一时间点与粪便微生物组高通量数据集进行比较，以寻找与已知微生物信号组的关系。

母体样本分析 将结合一般临床和人口统计数据分析围产期口腔、阴道和皮肤微生物组成。 将母体微生物群概况与之前的研究进行比较，并将数据与早期婴儿肠道微生物组数据进行检查，以评估微生物在母婴传播中的垂直和水平转移。 将从样本中提取 DNA，然后使用通用 16s RNA 引物生成 PCR 扩增子，对 PCR 产物进行纯化和定量。 然后将对每个个体的 16S rRNA 基因片段进行 Illumina Miseq 测序。 由于该技术产生的数据量巨大，因此后续的生物信息学和统计分析至关重要。

研究人员将使用最先进的方法分析粪便微生物群组成的微生物含量，可能包括但不限于测序和定量 PCR。

研究人员将结合一般临床和人口统计数据分析母体粪便微生物组成和粪便微生物宏基因组。 粪便微生物组成序列将揭示存在哪些细菌类型，宏基因组分析将表明微生物负荷的代谢潜力。 我们建议使用异源表达的宏基因组 DNA 的高通量筛选作为观察不同种群功能的一种手段，例如 代谢某些碳水化合物来源、毒素转化等的整体能力。 DNA 将按照婴儿粪便的概述从母体粪便中提取。

母乳分析 研究人员将结合一般临床和人口统计数据分析乳汁微生物组成和微生物宏基因组。 细菌概况将与之前关于母体肠道微生物组的研究进行比较，并将数据与婴儿粪便微生物组数据相关联，以评估母婴传播中微生物的水平转移。 异源表达的宏基因组 DNA 的高通量筛选将用作查看功能的一种手段，例如 代谢某些碳水化合物来源的整体能力（例如 人乳低聚糖）。 将从所有受试者的母乳中提取 DNA，然后使用通用 16s RNA 引物生成 PCR 扩增子，对 PCR 产物进行纯化和定量。 然后将对每个个体的 16S rRNA 基因片段进行 Illumina Miseq 测序。 噬菌体是微生物组组成的重要调节剂，在维持捕食者和猎物之间适当的乳汁生态系统平衡方面发挥着关键作用。 出于序列独立宏基因组测序的目的，将从人乳中分离噬菌体。 那些与免疫球蛋白相关的噬菌体将被类似地分离和测序。 由于该技术产生的数据量巨大，因此后续的生物信息学和统计分析至关重要。 生物信息学分析将与前面提到的其他生物样本相同。

所有分析方法都将根据最先进的方法进行适当更新。

样品储存 研究人员将立即收集所有母体样品，并在现场-20°C 下冷冻，直到它们可以运送到 APC Microbiome Ireland 的异地实验室进行尽快处理并冷冻储存。

所有在 NICU 中获得的婴儿样本都将储存在研究冰箱中，直到它们可以尽快运送到 APC Microbiome Ireland 的异地实验室进行处理并冷冻储存。

生物信息学分析 生物信息学分析将涉及以下内容，将使用 FLASH 组装 300 bp 的双端读数，并使用 QIIME 工具套件进一步处理双端读数，包括质量过滤和去除不匹配的条形码和低于长度的序列阈值。 OTU 序列将使用 PyNAST 进行比对，SILVA SSURef 数据库将用于确定分类。 将使用 QIIME 计算 Alpha 和 Beta 多样性。 最后，主坐标分析 (PCoA) 图将用于可视化基于 UniFrac 距离矩阵的 beta 多样性差异。

主要终点 主要研究终点将是最后一位参加者的 24 个月评估。 该研究旨在在 18 个月的时间内招募 80 - 100 名妊娠 32 周前出生的婴儿。 将对出生后的第一批样本进行分析，以检测婴儿肠道中现有的早期定植者（可能通过垂直传播），并确定这些早产儿体内微生物组的建立模式。

监管和行政程序 该研究将根据 1964 年赫尔辛基宣言的 2013 年 10 月巴西福塔莱萨版本进行。 该协议和参与者信息传单/ICF 将由科克教学医院的临床研究伦理委员会批准。

参与者信息/知情同意 本研究中使用的知情同意书以及研究期间所做的任何更改在使用前均已获得科克教学医院临床研究伦理委员会的前瞻性批准。 每份知情同意书将包括 ICH E6 良好临床实践指南 (GCP) 和 1988 年和 2003 年数据保护法以及 2018 年 5 月 25 日起的 GDPR 当前要求的所有相关要素。

参与者可以随时退出研究而不会造成损害。 此外，如果符合参与者的最佳利益，研究者可以让参与者退出研究。 参与者退出研究的原因将记录在参与者案例记录中。

GCP 和记录保留 本研究将根据最新的国际协调会议 (ICH) 良好临床实践 (GCP) 指南进行管理和实施。 研究者将根据医学和临床研究实践的最高标准执行或直接监督此处描述的所有服务或此处描述的附带服务的执行。 本研究期间收集的数据的使用和存储将遵守通用数据保护条例 (GDPR)（欧洲议会和理事会条例 (EU) 2016/679）和 2018 年数据保护法（第 36(2) 节） )（健康研究）条例 2018。