Mikrobiometablering hos prematura spädbarn (PIMENTO)

Arbete som gjorts tidigare har identifierat flera faktorer associerade med förändringar i den neonatala tarmmikrobiomet. Dessa inkluderar graviditetsålder, förlossningssätt, exponering för antibiotika och val av mat. Mödrar till spädbarn med mycket låg födelsevikt uppmuntras vanligtvis att konsumera bröstmjölk till sitt barn. Detta är associerat med lägre frekvenser av sepsis och nekrotiserande enterokolit. Vissa av dessa effekter kan vara relaterade till bakterierna som deras mamma får i bröstmjölk. Korrelationer mellan förändringar i det neonatala tarmmikrobiomet och mikrobiotan i mjölken de får är begränsade. Dessutom har effekten av frysning (dvs. standardpraxis för förvaring av bröstmjölk) på bröstmjölksmikrobiota inte karakteriserats väl. Dessutom, i avsaknad av Mother's Own Milk (MOM) är det kliniskt lämpligt att erbjuda Donor Human Milk, där den ytterligare pastöriseringsprocessen också kan påverka de bakteriestammar som finns däri och leda till ett förändrat mönster av kolonisering av neonataltarmen.

Detta är en prospektiv observationsstudie som kommer att utvärdera etableringen och utvecklingen av tarmmikrobiomet hos mycket för tidigt födda barn med hjälp av nästa generations sekvenseringstekniker. Data kommer att analyseras med hjälp av bioinformatik för att bedöma vertikal överföring från mor till spädbarn in utero, etablering och utveckling av mikrobiomet för prematura spädbarn och utvärdera hur strategier för neonatal intensivvårdsavdelning (NICU) förändrar mikrobiomets sammansättning och återhämtning efter interventioner. Detta arbete kommer att ge detaljerad information som kan utgöra grunden för utveckling av individualiserade probiotika för mycket för tidigt födda barn och kan hjälpa till att utveckla mikrobiomskyddande hanteringsstrategier för NICU.

Rekryterings- och samtyckesprocess Gravida kvinnor kommer att kontaktas om det finns möjlighet till förlossning före 32 veckors graviditet. En informationsbroschyr för deltagare kommer att tillhandahållas som beskriver syftet med studien och vad som förväntas av deltagarna. Studien kommer också att förklaras av en forskare. Frågor kommer att besvaras och tillräckligt med tid för överläggning kommer att ges. Om de vill delta med sitt spädbarn måste de förmodat kvalificerade deltagarna underteckna formuläret för informerat samtycke (ICF). De kommer att få en kopia av det undertecknade samtyckesformuläret. Uppskjutet samtycke kommer att tillåtas men eventuella spädbarnsprover som samlas in kommer att lagras på plats och kommer inte att behandlas innan samtycke erhålls. Om samtycke nekas kommer alla insamlade prover att kasseras omedelbart.

Inklusions-/exkluderingskriterier kommer att bedömas vid alla tidpunkter från screening till informerat samtycke till förlossning av barnet. Deltagare kan dras ur studien om uteslutningskriterierna uppfylls postnatalt. För inklusions-/exkluderingskriterier, se avsnitt 4.1/4.2. Flera förlossningar kommer att registreras separat. Prover kommer att samlas in från varje spädbarn men endast en uppsättning av moderns prover skulle samlas in. I händelse av att den ena tvillingen förlossas vaginalt och den andra med kejsarsnitt kommer både hud- och vaginalprover att samlas in från modern om möjligt.

Information om demografi, förlossning, auxologi, utfodring, antibiotika och komorbiditeter kommer att samlas in från deltagarna. Dessutom kommer en Bayley-skala av spädbarns- och småbarnsutveckling att utföras vid 2 års ålder för att bedöma neuroutvecklingen.

Provsamling

Spädbarnsprover

Mekonium- och avföringsprover. Avföringsprover kommer att utföras vid stugan. Rektalprover, utförda av den mottagande kliniska sjuksköterskan, tas rutinmässigt vid inläggning på NICU. En extra pinne kommer att tas för mikrobiomanalys vid denna tidpunkt. Under den neonatala intagningen kommer ett prov av det första mekoniumet som passerats att tas från blöjan och därefter tas prov från avföring från barnets blöja varannan vecka, om möjligt, under rutinvård.

Spädbarnsurin Under slutenvården kommer urin att samlas upp varje vecka av neonatalsköterskan genom att placera en steril kudde/servetter i spädbarnets blöja som sedan tas bort vid nästa rutinvård.

Spädbarnsblod Blodprover tas endast vid tidpunkten för venpunktion av en kliniskt indikerad anledning. Venepunktion och provtagning kommer att utföras av det kliniska teamet. Högst 1 % av ett spädbarns beräknade totala blodvolym (eTBV) (80 ml/kg) kommer att samlas in vid någon tidpunkt för forskningsändamål (eTBV=80 ml/kg). Tidpunkter för blodprovtagning kommer att vara inom den första veckan av livet (dvs. före utfodring), mellan 2 och 4 levnadsveckor (dvs. när enteral matning har etablerats helt) och före utskrivning. Venepunktion i syfte att samla in ett forskningsprov kommer inte att tillåtas.

Maternal prover

Orala pinnprover Orala prover kommer att samlas in av forskningssköterskan/utredaren så snart som möjligt efter födseln från modern med hjälp av en steril pinne.

Vaginala pinnprover (vaginalt förlossningar) En vaginala pinnprover tas från modern av den behandlande barnmorskan eller förlossningsläkaren på förlossningsavdelningen eller av modern själv på förlossningsavdelningen.

Hudpinne (förlossningar med kejsarsnitt) En hudpinne kommer att erhållas från modern av forskningssköterskan/utredaren efter förlossningen. Det kommer att samlas in från den inre delen av handleden under deltagarens sjukhusarmband.

Maternal avföringsprov Deltagarna kommer att förses med kit och instruktioner för att samla avföringsprover. Prover kommer att frysas så snart de tillhandahålls och samlas in av forskargruppen.

Bröstmjölk Bröstmjölksprover av MOM kommer att samlas in från mödrar under hela studien. Mödrar kommer att uppmanas att ge ett 5-15 ml bröstmjölksprov (om möjligt) varannan vecka medan deras spädbarn är på neonatalavdelningen om hon har tillräckligt med förråd.

Provanalys

Analys för spädbarnsavföring High-throughput screening av heterologt uttryckt metagenomiskt DNA kommer att undersökas som ett sätt att titta på funktionaliteten t.ex. övergripande förmåga att metabolisera vissa kolhydratkällor (dvs. bröstmjölk). DNA kommer att extraheras från avföringen från alla spädbarn följt av generering av PCR-amplikoner med användning av universella 16s RNA-primrar, rening och kvantifiering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering kommer sedan att utföras på 16S rRNA-genfragment per individ. På grund av den stora mängd data som genereras från denna teknik är efterföljande bioinformatisk och statistisk analys nödvändig.

Analys för spädbarnsurin Oriktade LC-MS-analyser kommer att utföras med en hybrid linjär jonfälla Fourier Transform (LTQ FT) Orbitrap-masspektrometer. XCMS Online-portalen (https://xcmsonline.scripps.edu/) kommer att användas för databearbetning (anpassning, toppplockning, noll toppåterintegrering, funktionsgruppering och bedömning av kvalitetskontrollprover). För att kommentera föreningar kommer en urvalsstrategi att användas baserat på de mest förekommande och de mest statistiskt signifikanta egenskaperna. För att underlätta identifieringen av metaboliter kommer ytterligare en klustringsanalys att utföras med användning av Spearman-korrelationsanalys.

Analys för spädbarnsblod Blodprover kommer att undersökas i relation till funktionell metabolomik, inklusive, men inte begränsat till, analys med användning av hagelgevärs metabolomics och jämförelse med avföringsmikrobiomets höggenomströmningsdatauppsättningar samtidigt som man letar efter relationer till kända mikrobiella signalgrupper.

Analys av moderns prover Den peri-partum orala, vaginala och hudmikrobiella sammansättningen, i samband med allmänna kliniska och demografiska data, kommer att analyseras. Jämförelse kommer att göras mellan moderns mikrobiotaprofiler med tidigare studier och data kommer att undersökas med de tidiga tarmmikrobiomdata för spädbarn för att bedöma den vertikala och horisontella överföringen av mikroorganismer vid överföring från moder till spädbarn. DNA kommer att extraheras från prover, följt av generering av PCR-amplikoner med användning av universella 16s RNA-primers, rening och kvantifiering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering kommer sedan att utföras på 16S rRNA-genfragment per individ. På grund av den stora mängd data som genereras från denna teknik är efterföljande bioinformatisk och statistisk analys nödvändig.

Avföringsmikrobiotans sammansättning kommer att analyseras med avseende på deras mikrobiella innehåll av utredarna med hjälp av toppmoderna metoder, möjligen inklusive men inte begränsat till sekvensering och kvantitativ PCR.

Utredarna kommer att analysera moderns fekala mikrobiella sammansättning, och det fekala mikrobiella metagenomet, i samband med allmänna kliniska och demografiska data. Fekala mikrobiella sammansättningssekvenser kommer att avslöja vilka bakterietyper som finns, och metagenomiska analyser kommer att indikera den metaboliska potentialen för den mikrobiella belastningen. Vi föreslår att använda high-throughput screening av heterologt uttryckt metagenomiskt DNA som ett sätt att titta på funktionaliteten hos olika populationer, t.ex. övergripande förmåga att metabolisera vissa kolhydratkällor, omvandling av toxiner etc. DNA kommer att extraheras från moderns avföring enligt beskrivningen för spädbarnets avföring.

Analys för bröstmjölk Utredarna kommer att analysera mjölkens mikrobiella sammansättning, och mikrobiellt metagenom, i samband med allmänna kliniska och demografiska data. Bakterieprofiler kommer att jämföras med tidigare studier som rapporterats om moderns tarmmikrobiome och korrelerar data med data från spädbarnsavföringsmikrobiomet för att bedöma horisontell överföring av mikroorganismer vid överföring av moder till spädbarn. High-throughput screening av heterologt uttryckt metagenomiskt DNA kommer att användas som ett sätt att titta på funktionaliteten t.ex. övergripande förmåga att metabolisera vissa kolhydratkällor (t.ex. oligosackarider från bröstmjölk). DNA kommer att extraheras från bröstmjölken från alla försökspersoner, följt av generering av PCR-amplikoner med användning av universella 16s RNA-primers, rening och kvantifiering av PCR-produkter. Illumina Miseq-sekvensering kommer sedan att utföras på 16S rRNA-genfragment per individ. Bakteriofager är viktiga regulatorer av mikrobiomsammansättningen och spelar en nyckelroll för att upprätthålla lämplig jämvikt mellan rovdjur och byte i mjölkekosystemet. Bakteriofager kommer att isoleras från bröstmjölk i syfte att sekvensoberoende metagenomisk sekvensering. De bakteriofager som är associerade med immunglobuliner kommer att isoleras och sekvenseras på liknande sätt. På grund av den stora mängd data som genereras från denna teknik är efterföljande bioinformatisk och statistisk analys nödvändig. Bioinformatisk analys kommer att vara densamma som tidigare nämnts för de andra biologiska proverna.

Alla analysmetoder kommer att uppdateras vid behov i enlighet med den senaste metoden.

Förvaring av prover Alla prover från modern kommer omedelbart att samlas in av forskaren och frysas på plats vid -20°C tills de kan transporteras till laboratoriet utanför anläggningen vid APC Microbiome Ireland för bearbetning så snart som möjligt och frysning för lagring.

Alla spädbarnsprover som erhålls på NICU kommer att förvaras i forskningsfrysen tills de kan transporteras till laboratoriet utanför anläggningen vid APC Microbiome Ireland för bearbetning så snart som möjligt och frysning för lagring.

Bioinformatisk analys Bioinformatisk analys kommer att involvera följande, 300 bp parad-end-läsningar kommer att sammanställas med FLASH och QIIME-sviten av verktyg kommer att användas för vidare bearbetning av paired-end-läsningar, inklusive kvalitetsfiltrering och borttagning av felaktiga streckkoder och sekvenser under längden trösklar. OTU-sekvenser kommer att anpassas med PyNAST och SILVA SSURef-databasen kommer att användas för att bestämma taxonomi. Alfa- och betadiversiteter kommer att beräknas med QIIME. Slutligen kommer plotter för principal koordinatanalys (PCoA) att användas för att visualisera skillnader i beta-diversitet baserat på UniFrac-distansmatriser.

Primär endpoint Den primära studiens endpoint kommer att vara 24-månadersbedömningen av den senast inskrivna deltagaren. Studien syftar till att registrera 80 - 100 spädbarn födda före 32 veckors graviditet under en 18-månadersperiod. Analyser kommer att utföras från de första proverna efter födseln för att upptäcka befintliga, tidiga kolonisatörer av spädbarnets tarm (sannolikt genom vertikal överföring) och fastställa mönster för mikrobiometablering hos dessa för tidigt födda spädbarn.

Regulatoriska och administrativa förfaranden Studien kommer att genomföras i enlighet med versionen Fortaleza, Brasilien, oktober 2013 av Helsingforsdeklarationen 1964. Protokollet och deltagarinformationsbroschyren/ICF kommer att godkännas av den kliniska forskningsetiska kommittén vid Cork Teaching Hospitals.

Deltagarinformation/Informerat samtycke Formen för informerat samtycke som används i denna studie, och alla ändringar som gjorts under studien, har godkänts av den kliniska forskningsetiska kommittén vid Cork Teaching Hospitals före användning. Varje formulär för informerat samtycke kommer att innehålla alla relevanta delar som för närvarande krävs av ICH E6 Guideline for Good Clinical Practice (GCP) och Data Protection Act från 1988 och 2003, och GDPR från 25 maj 2018.

Deltagarna kan när som helst avbryta sitt deltagande i studien utan nackdel. Dessutom kan utredaren dra tillbaka deltagare från studien om det ligger i deltagarens bästa. Orsaken till att deltagarna drar sig ur studien kommer att dokumenteras i deltagarnas fallanteckningar.

GCP och journalbevarande Studien kommer att hanteras och genomföras enligt de senaste riktlinjerna för internationella harmoniseringskonferenser (ICH) för god klinisk praxis (GCP). Utredaren kommer att utföra eller direkt övervaka utförandet av alla tjänster som beskrivs häri, eller andra till de som beskrivs häri, i enlighet med de högsta standarderna för medicinsk och klinisk forskning. Användningen och lagringen av data som samlas in under denna studie kommer att följa den allmänna dataskyddsförordningen (GDPR) (Europaparlamentets och rådets förordning (EU) 2016/679) och dataskyddslagen 2018 (avsnitt 36(2) ) (Hälsoforskning) förordningar 2018.