Établissement du microbiome chez les prématurés (PIMENTO)

Les travaux effectués précédemment ont identifié plusieurs facteurs associés aux altérations du microbiome intestinal néonatal. Il s'agit notamment de l'âge gestationnel, du mode d'accouchement, de l'exposition aux antibiotiques et du choix de l'alimentation. Les mères de nourrissons de très faible poids à la naissance sont généralement encouragées à exprimer le lait maternel pour leur bébé. Ceci est associé à des taux plus faibles de septicémie et d'entérocolite nécrosante. Certains de ces effets peuvent être liés aux bactéries reçues dans le lait maternel par leur mère. Les corrélations entre les changements du microbiote intestinal néonatal et le microbiote du lait qu'ils reçoivent sont limitées. De plus, l'effet de la congélation (c'est-à-dire la pratique standard de conservation du lait maternel) sur le microbiote du lait maternel n'a pas été bien caractérisé. De plus, en l'absence de lait maternel (MOM), il est cliniquement approprié d'offrir du lait maternel de donneuse, où le processus supplémentaire de pasteurisation peut également affecter les souches bactériennes présentes et entraîner une altération du schéma de colonisation de l'intestin néonatal.

Il s'agit d'une étude observationnelle prospective qui évaluera l'établissement et l'évolution du microbiome intestinal de grands prématurés à l'aide de techniques de séquençage de nouvelle génération. Les données seront analysées à l'aide de la bioinformatique pour évaluer la transmission verticale de la mère au nourrisson in utero, l'établissement et l'évolution du microbiome du nourrisson prématuré et évaluer comment les stratégies de gestion de l'unité néonatale de soins intensifs (USIN) modifient la composition du microbiome et sa récupération après les interventions. Ce travail fournira des informations détaillées qui pourraient servir de base au développement de probiotiques individualisés pour les nourrissons très prématurés et pourraient aider à développer des stratégies de gestion protectrice du microbiome pour l'USIN.

Processus de recrutement et de consentement Les femmes enceintes seront approchées s'il y a une possibilité d'accouchement avant 32 semaines de gestation. Une brochure d'information pour les participants sera fournie qui détaillera le but de l'étude et ce qui serait attendu des participants. L'étude sera également expliquée par un chercheur. Les questions recevront une réponse et un temps suffisant pour délibérer sera accordé. S'ils souhaitent participer avec leur bébé, les participants présumés éligibles doivent signer le formulaire de consentement éclairé (ICF). Ils recevront une copie du formulaire de consentement signé. Le consentement différé sera autorisé, mais tous les échantillons de nourrissons prélevés seront stockés sur place et ne seront pas traités avant l'obtention du consentement. Si le consentement est refusé, tous les échantillons prélevés seront immédiatement éliminés.

Les critères d'inclusion/exclusion seront évalués à tous les moments, du dépistage au consentement éclairé à l'accouchement du nourrisson. Les participants peuvent être retirés de l'étude si les critères d'exclusion sont remplis après la naissance. Pour les critères d'inclusion/exclusion, voir les sections 4.1/4.2. Les naissances multiples seront inscrites séparément. Des échantillons seront prélevés sur chaque nourrisson, mais un seul ensemble d'échantillons maternels sera prélevé. Dans le cas où un jumeau est accouché par voie vaginale et l'autre par césarienne, des écouvillons cutanés et vaginaux seront prélevés chez la mère si possible.

Des informations concernant la démographie, l'accouchement, l'auxologie, l'alimentation, les antibiotiques et les comorbidités seront recueillies auprès des participants. De plus, une échelle de Bayley du développement des nourrissons et des tout-petits sera réalisée à l'âge de 2 ans pour évaluer le développement neurologique.

Collecte d'échantillons

Échantillons pour nourrissons

Prélèvements de méconium et de selles Le prélèvement de selles sera effectué au lit de camp. Des écouvillonnages rectaux, effectués par l'infirmière clinicienne chargée de l'admission, sont effectués systématiquement à l'admission à l'USIN. Un écouvillon supplémentaire sera prélevé pour l'analyse du microbiome à ce moment. Lors de l'admission néonatale, un échantillon du premier méconium évacué sera prélevé sur la couche, puis les selles seront prélevées sur la couche du nourrisson toutes les deux semaines, si possible, lors des soins de routine.

Urine du nourrisson Pendant le séjour en hospitalisation, l'urine sera recueillie chaque semaine par l'infirmière néonatale en plaçant un tampon / des tampons stériles dans la couche du nourrisson qui seront ensuite retirés lors des prochains soins de routine.

Sang du nourrisson Les échantillons de sang ne seront prélevés qu'au moment de la ponction veineuse pour une raison cliniquement indiquée. La ponction veineuse et le prélèvement d'échantillons seront effectués par l'équipe clinique. Pas plus de 1 % du volume sanguin total estimé (eTBV) d'un nourrisson (80 ml/kg) sera prélevé à un moment donné à des fins de recherche (eTBV = 80 ml/kg). Les points temporels pour le prélèvement d'échantillons de sang se situeront dans la première semaine de vie (c.-à-d. avant l'établissement de l'alimentation), entre 2 et 4 semaines de vie (c'est-à-dire une fois l'alimentation entérale pleinement établie) et avant la sortie. La ponction veineuse dans le seul but de recueillir un échantillon de recherche ne sera pas autorisée.

Échantillons maternels

Écouvillons oraux Des échantillons oraux seront prélevés par l'infirmière de recherche/investigateur dès que possible après la naissance de la mère à l'aide d'un écouvillon stérile.

Écouvillon vaginal (Accouchements vaginaux) Un écouvillon vaginal sera prélevé sur la mère par la sage-femme ou l'obstétricien traitant dans la salle d'accouchement, ou par la mère elle-même dans le service postnatal.

Écouvillon cutané (accouchements par césarienne) Un écouvillon cutané sera obtenu de la mère par l'infirmière de recherche/investigateur après l'accouchement. Il sera prélevé sur la face interne du poignet sous le bracelet de l'hôpital du participant.

Échantillons de selles maternelles Les participants recevront des kits et des instructions pour prélever des échantillons de selles. Les échantillons seront congelés dès qu'ils seront fournis et recueillis par l'équipe de recherche.

Lait maternel Des échantillons de lait maternel de maman seront prélevés auprès des mères tout au long de l'étude. Les mères seront invitées à fournir un échantillon de lait maternel de 5 à 15 ml (si possible) toutes les deux semaines pendant que leur nourrisson est à l'USIN si elle en a suffisamment.

Analyse d'échantillon

Analyse des selles du nourrisson Le criblage à haut débit de l'ADN métagénomique exprimé de manière hétérologue sera examiné comme moyen d'examiner la fonctionnalité, par ex. capacité globale à métaboliser certaines sources de glucides (c.-à-d. lait maternel). L'ADN sera extrait des matières fécales de tous les nourrissons, suivi de la génération d'amplicons PCR à l'aide d'amorces d'ARN 16s universelles, de la purification et de la quantification des produits PCR. Le séquençage d'Illumina Miseq sera ensuite réalisé sur des fragments de gènes d'ARNr 16S par individu. En raison de la grande quantité de données générées par cette technologie, une analyse bioinformatique et statistique ultérieure est essentielle.

Analyse de l'urine des nourrissons Des tests LC-MS non ciblés seront effectués avec un spectromètre de masse Orbitrap à piège à ions linéaire hybride à transformée de Fourier (LTQ FT). Le portail XCMS Online (https://xcmsonline.scripps.edu/) seront utilisés pour le traitement des données (alignement, sélection des pics, réintégrations des pics zéro, regroupement des caractéristiques et évaluation des échantillons de contrôle qualité). Pour annoter les composés, une stratégie de sélection sera utilisée en fonction des caractéristiques les plus abondantes et les plus statistiquement significatives. Pour faciliter l'identification des métabolites, une analyse de regroupement supplémentaire sera effectuée à l'aide de l'analyse de corrélation de Spearman.

Analyse du sang infantile Les échantillons de sang seront examinés en relation avec la métabolomique fonctionnelle, y compris, mais sans s'y limiter, l'analyse à l'aide de la métabolomique du fusil de chasse et la comparaison avec les ensembles de données à haut débit du microbiome des selles aux mêmes moments à la recherche de relations avec des groupes de signalisation microbienne connus.

Analyse des échantillons maternels La composition microbienne péri-partum orale, vaginale et cutanée, en conjonction avec les données cliniques et démographiques générales, sera analysée. Une comparaison sera faite entre les profils du microbiote maternel avec les études précédentes et les données seront examinées avec les données du microbiome intestinal du nourrisson pour évaluer le transfert vertical et horizontal des micro-organismes dans la transmission mère-enfant. L'ADN sera extrait des échantillons, suivi de la génération d'amplicons PCR à l'aide d'amorces d'ARN 16s universelles, de la purification et de la quantification des produits PCR. Le séquençage d'Illumina Miseq sera ensuite réalisé sur des fragments de gènes d'ARNr 16S par individu. En raison de la grande quantité de données générées par cette technologie, une analyse bioinformatique et statistique ultérieure est essentielle.

La composition du microbiote des selles sera analysée pour leur contenu microbien par les enquêteurs à l'aide de méthodes de pointe, y compris éventuellement, mais sans s'y limiter, le séquençage et la PCR quantitative.

Les chercheurs analyseront la composition microbienne fécale maternelle et le métagénome microbien fécal, en conjonction avec des données cliniques et démographiques générales. Les séquences de composition microbienne fécale révéleront quels types de bactéries sont présents et les analyses métagénomiques indiqueront le potentiel métabolique de la charge microbienne. Nous proposons d'utiliser le criblage à haut débit d'ADN métagénomique exprimé de manière hétérologue comme moyen d'examiner la fonctionnalité de différentes populations, par ex. capacité globale à métaboliser certaines sources de glucides, transformation de toxines, etc. L'ADN sera extrait des matières fécales maternelles comme indiqué pour les selles du nourrisson.

Analyse du lait maternel Les enquêteurs analyseront la composition microbienne du lait et le métagénome microbien, en conjonction avec des données cliniques et démographiques générales. Les profils bactériens seront comparés aux études précédentes rapportées sur le microbiome intestinal maternel et corréleront les données avec les données sur le microbiome des selles infantiles pour évaluer le transfert horizontal de micro-organismes dans la transmission mère-enfant. Le criblage à haut débit d'ADN métagénomique exprimé de manière hétérologue sera utilisé comme moyen d'examiner la fonctionnalité, par ex. capacité globale à métaboliser certaines sources de glucides (par ex. oligosaccharides du lait maternel). L'ADN sera extrait du lait maternel de tous les sujets, suivi de la génération d'amplicons PCR à l'aide d'amorces d'ARN 16s universelles, de la purification et de la quantification des produits PCR. Le séquençage d'Illumina Miseq sera ensuite réalisé sur des fragments de gènes d'ARNr 16S par individu. Les bactériophages sont d'importants régulateurs de la composition du microbiome et jouent un rôle clé dans le maintien de l'équilibre approprié de l'écosystème laitier entre prédateurs et proies. Le bactériophage sera isolé du lait maternel à des fins de séquençage métagénomique indépendant de la séquence. Les bactériophages associés aux immunoglobulines seront de la même manière isolés et séquencés. En raison de la grande quantité de données générées par cette technologie, une analyse bioinformatique et statistique ultérieure est essentielle. L'analyse bioinformatique sera la même que celle mentionnée précédemment pour les autres échantillons biologiques.

Toutes les méthodes d'analyse seront mises à jour, le cas échéant, conformément à la méthodologie de pointe.

Stockage des échantillons Tous les échantillons maternels seront prélevés immédiatement par le chercheur et congelés sur place à -20 °C jusqu'à ce qu'ils puissent être transportés vers le laboratoire hors site d'APC Microbiome Ireland pour traitement dès que possible et congélation pour stockage.

Tous les échantillons de nourrissons obtenus à l'USIN seront stockés dans le congélateur de recherche jusqu'à ce qu'ils puissent être transportés au laboratoire hors site d'APC Microbiome Ireland pour être traités dès que possible et congelés pour le stockage.

Analyse bioinformatique L'analyse bioinformatique impliquera les éléments suivants : des lectures d'extrémité appariées de 300 bp seront assemblées à l'aide de FLASH et la suite d'outils QIIME sera utilisée pour le traitement ultérieur des lectures d'extrémité appariée, y compris le filtrage de qualité et la suppression des codes-barres incompatibles et des séquences inférieures à la longueur seuils. Les séquences OTU seront alignées à l'aide de PyNAST et la base de données SILVA SSURef sera utilisée pour déterminer la taxonomie. Les diversités alpha et bêta seront calculées à l'aide de QIIME. Enfin, des graphiques d'analyse des coordonnées principales (PCoA) seront utilisés pour visualiser les différences de diversité bêta sur la base des matrices de distance UniFrac.

Critère d'évaluation principal Le critère d'évaluation principal de l'étude sera l'évaluation à 24 mois du dernier participant inscrit. L'étude vise à recruter 80 à 100 nourrissons nés avant 32 semaines de gestation sur une période de 18 mois. Des analyses seront effectuées à partir des premiers échantillons après la naissance pour détecter les colonisateurs précoces existants de l'intestin du nourrisson (probablement par transmission verticale) et déterminer les modèles d'établissement du microbiome chez ces nourrissons prématurés.

Procédures réglementaires et administratives L'étude sera menée conformément à la version Fortaleza, Brésil, octobre 2013 de la Déclaration d'Helsinki 1964. Le protocole et la notice d'information du participant/ICF seront approuvés par le comité d'éthique de la recherche clinique des hôpitaux universitaires de Cork.

Informations sur les participants/consentement éclairé Le formulaire de consentement éclairé utilisé dans cette étude et toute modification apportée au cours de l'étude ont été approuvés de manière prospective par le comité d'éthique de la recherche clinique des hôpitaux universitaires de Cork avant utilisation. Chaque formulaire de consentement éclairé comprendra tous les éléments pertinents actuellement requis par la directive ICH E6 pour les bonnes pratiques cliniques (BPC) et la loi sur la protection des données de 1988 et 2003, et le RGPD du 25 mai 2018.

Les participants peuvent se retirer de la participation à l'étude à tout moment sans préjudice. De plus, l'investigateur peut retirer des participants de l'étude si c'est dans le meilleur intérêt du participant. La raison du retrait des participants de l'étude sera documentée dans les notes de cas des participants.

BPC et conservation des dossiers L'étude sera gérée et menée conformément aux dernières directives de la Conférence internationale sur l'harmonisation (ICH) pour les bonnes pratiques cliniques (BPC). L'investigateur exécutera ou supervisera directement l'exécution de tous les services décrits ici, ou accessoires à ceux décrits ici, conformément aux normes les plus élevées de la pratique de la recherche médicale et clinique. L'utilisation et le stockage des données collectées au cours de cette étude seront conformes au règlement général sur la protection des données (RGPD) (règlement (UE) 2016/679 du Parlement européen et du Conseil) et à la loi sur la protection des données de 2018 (article 36(2) ) (Recherche en santé) Règlement de 2018.