Stabilimento del microbioma nei neonati prematuri (PIMENTO)

Il lavoro svolto in precedenza ha identificato diversi fattori associati alle alterazioni del microbioma intestinale neonatale. Questi includono l'età gestazionale, la modalità di consegna, l'esposizione agli antibiotici e la scelta dell'alimentazione. Le madri di neonati con peso alla nascita molto basso sono generalmente incoraggiate a estrarre il latte materno per il loro bambino. Ciò è associato a tassi più bassi di sepsi e di enterocolite necrotizzante. Alcuni di questi effetti possono essere correlati ai batteri ricevuti nel latte materno dalla madre. Le correlazioni tra i cambiamenti nel microbioma intestinale neonatale e il microbiota del latte che vengono nutriti sono limitate. Inoltre, l'effetto del congelamento (ovvero la pratica standard di conservazione del latte materno) sul microbiota del latte materno non è stato ben caratterizzato. Inoltre, in assenza di latte materno (MOM), è clinicamente appropriato offrire latte umano donato, in cui l'ulteriore processo di pastorizzazione può influenzare anche i ceppi batterici presenti e portare a un modello alterato di colonizzazione dell'intestino neonatale.

Si tratta di uno studio osservazionale prospettico che valuterà l'instaurazione e l'evoluzione del microbioma intestinale di neonati molto pretermine utilizzando tecniche di sequenziamento di nuova generazione. I dati saranno analizzati utilizzando la bioinformatica per valutare la trasmissione verticale dalla madre al bambino in utero, l'istituzione e l'evoluzione del microbioma del neonato pretermine e valutare come le strategie di gestione dell'unità di terapia intensiva neonatale (NICU) alterano la composizione del microbioma e il recupero dopo gli interventi. Questo lavoro fornirà informazioni dettagliate che potrebbero fornire la base per lo sviluppo di probiotici personalizzati per neonati molto pretermine e potrebbe aiutare a sviluppare strategie di gestione della protezione del microbioma per la terapia intensiva neonatale.

Processo di reclutamento e consenso Le donne in gravidanza verranno contattate se esiste la possibilità di parto prima della 32a settimana di gestazione. Verrà fornito un opuscolo informativo per i partecipanti che descriverà in dettaglio lo scopo dello studio e cosa ci si aspetterebbe dai partecipanti. Lo studio sarà spiegato anche da un ricercatore. Alle domande verrà data risposta e sarà concesso tempo sufficiente per deliberare. Se desiderano partecipare con il loro bambino, i partecipanti presumibilmente idonei devono firmare il modulo di consenso informato (ICF). Riceveranno una copia del modulo di consenso firmato. Il consenso differito sarà consentito, ma tutti i campioni di neonati raccolti saranno conservati in loco e non saranno elaborati prima dell'ottenimento del consenso. Se il consenso viene rifiutato, tutti i campioni raccolti verranno eliminati immediatamente.

I criteri di inclusione/esclusione saranno valutati in tutti i momenti dallo screening al consenso informato al parto. I partecipanti possono essere ritirati dallo studio se i criteri di esclusione sono soddisfatti dopo la nascita. Per i criteri di inclusione/esclusione vedere le sezioni 4.1/4.2. Le nascite multiple saranno registrate separatamente. I campioni verranno raccolti da ciascun bambino, ma verrà raccolto solo un set di campioni materni. Nel caso in cui un gemello venga partorito per via vaginale e l'altro con taglio cesareo, se possibile verranno prelevati dalla madre sia i tamponi cutanei che quelli vaginali.

Informazioni riguardanti dati demografici, parto, auxologia, alimentazione, antibiotici e comorbidità saranno raccolte dai partecipanti. Inoltre, a 2 anni di età verrà eseguita una scala Bayley di sviluppo del neonato e del bambino per valutare lo sviluppo neurologico.

Raccolta di campioni

Campioni infantili

Campioni di meconio e feci Il campionamento delle feci sarà effettuato a bordo campo. I tamponi rettali, eseguiti dall'infermiere clinico ricoverante, vengono prelevati di routine al momento del ricovero in terapia intensiva neonatale. In questo momento verrà prelevato un tampone aggiuntivo per l'analisi del microbioma. Durante il ricovero neonatale, verrà raccolto un campione del primo meconio passato dal pannolino e successivamente le feci verranno prelevate dal pannolino del neonato ogni due settimane, se possibile, durante le cure di routine.

Urina del neonato Durante la degenza ospedaliera l'urina verrà raccolta settimanalmente dall'infermiera neonatale inserendo uno o più tamponi sterili nel pannolino del neonato che verrà poi rimosso alla successiva occorrenza delle cure di routine.

Sangue infantile I campioni di sangue verranno raccolti solo al momento della venopuntura per un motivo clinicamente indicato. La venipuntura e la raccolta del campione saranno effettuate dal team clinico. Non più dell'1% del volume sanguigno totale stimato (eTBV) di un neonato (80 ml/kg) sarà raccolto in un determinato momento per scopi di ricerca (eTBV=80 ml/kg). I punti temporali per la raccolta del campione di sangue saranno entro la prima settimana di vita (es. prima dell'istituzione dell'alimentazione), tra 2 e 4 settimane di vita (es. una volta che l'alimentazione enterale è stata completamente stabilita) e prima della dimissione. La venipuntura al solo scopo di raccogliere un campione di ricerca non sarà consentita.

Campioni materni

Tamponi orali I campioni orali saranno raccolti dall'infermiere/ricercatore ricercatore appena possibile dopo la nascita dalla madre utilizzando un tampone sterile.

Tampone vaginale (Parti vaginali) Un tampone vaginale verrà prelevato dalla madre dall'ostetrica o dall'ostetrica curante nella sala parto, o dalla madre stessa nel reparto postnatale.

Tampone cutaneo (Parti con taglio cesareo) Un tampone cutaneo sarà ottenuto dalla madre dall'infermiere/ricercatore ricercatore dopo il parto. Verrà raccolto dall'aspetto interno del polso sotto il cinturino da polso dell'ospedale del partecipante.

Campioni di feci materne Ai partecipanti verranno forniti kit e istruzioni per raccogliere campioni di feci. I campioni saranno congelati non appena forniti e raccolti dal gruppo di ricerca.

Latte materno Campioni di latte materno di MOM saranno raccolti dalle madri durante lo studio. Alle madri verrà chiesto di fornire un campione di latte materno di 5-15 ml (se possibile) ogni due settimane mentre il loro bambino è in terapia intensiva neonatale se ha una scorta adeguata.

Analisi del campione

Analisi per feci infantili Lo screening ad alto rendimento del DNA metagenomico espresso in modo eterologo sarà esaminato come mezzo per esaminare la funzionalità, ad es. capacità complessiva di metabolizzare determinate fonti di carboidrati (ad es. latte materno). Il DNA verrà estratto dalle feci di tutti i neonati seguito dalla generazione di ampliconi PCR utilizzando primer universali 16s RNA, purificazione e quantificazione dei prodotti PCR. Il sequenziamento Illumina Miseq sarà quindi effettuato su frammenti di geni 16S rRNA per individuo. A causa della grande quantità di dati generati da questa tecnologia, la successiva analisi bioinformatica e statistica è essenziale.

Analisi per l'urina infantile Saggi LC-MS non mirati saranno eseguiti con uno spettrometro di massa Orbitrap a trappola ionica lineare ibrida a trasformata di Fourier (LTQ FT). Il portale XCMS Online (https://xcmsonline.scripps.edu/) verrà utilizzato per l'elaborazione dei dati (allineamento, selezione dei picchi, reintegrazione dei picchi zero, raggruppamento delle caratteristiche e valutazione dei campioni di controllo di qualità). Per annotare i composti, verrà utilizzata una strategia di selezione basata sulle caratteristiche più abbondanti e statisticamente più significative. Per facilitare l'identificazione dei metaboliti, verrà eseguita un'ulteriore analisi di clustering utilizzando l'analisi di correlazione di Spearman.

Analisi per sangue infantile I campioni di sangue saranno esaminati in relazione alla metabolomica funzionale, inclusa, ma non limitata a, l'analisi utilizzando la metabolomica del fucile da caccia e il confronto con i set di dati ad alta produttività del microbioma delle feci allo stesso tempo alla ricerca di relazioni con noti gruppi di segnalazione microbica.

Analisi dei campioni materni Verrà analizzata la composizione microbica orale, vaginale e cutanea peri-parto, unitamente ai dati clinici e demografici generali. Verrà effettuato un confronto tra i profili del microbiota materno con studi precedenti e i dati saranno esaminati con i dati del microbioma intestinale del primo bambino per valutare il trasferimento verticale e orizzontale di microrganismi nella trasmissione materno-infantile. Il DNA sarà estratto dai campioni, seguito dalla generazione di ampliconi di PCR utilizzando primer di RNA 16s universali, purificazione e quantificazione dei prodotti di PCR. Il sequenziamento Illumina Miseq sarà quindi effettuato su frammenti di geni 16S rRNA per individuo. A causa della grande quantità di dati generati da questa tecnologia, la successiva analisi bioinformatica e statistica è essenziale.

La composizione del microbiota fecale sarà analizzata per il loro contenuto microbico dagli investigatori utilizzando metodi all'avanguardia, possibilmente inclusi ma non limitati al sequenziamento e alla PCR quantitativa.

Gli investigatori analizzeranno la composizione microbica fecale materna e il metagenoma microbico fecale, insieme a dati clinici e demografici generali. Le sequenze composizionali microbiche fecali riveleranno quali tipi batterici sono presenti e le analisi metagenomiche indicheranno il potenziale metabolico della carica microbica. Proponiamo di utilizzare lo screening ad alto rendimento del DNA metagenomico espresso in modo eterologo come mezzo per esaminare la funzionalità di diverse popolazioni, ad es. capacità complessiva di metabolizzare determinate fonti di carboidrati, trasformazione delle tossine, ecc. Il DNA verrà estratto dalle feci materne come indicato per le feci infantili.

Analisi per il latte materno I ricercatori analizzeranno la composizione microbica del latte e il metagenoma microbico, insieme ai dati clinici e demografici generali. I profili batterici saranno confrontati con studi precedenti riportati sul microbioma intestinale materno e correleranno i dati con i dati del microbioma fecale infantile per valutare il trasferimento orizzontale di microrganismi nella trasmissione materno-infantile. Lo screening ad alto rendimento del DNA metagenomico espresso in modo eterologo sarà utilizzato come mezzo per esaminare la funzionalità, ad es. capacità complessiva di metabolizzare determinate fonti di carboidrati (ad es. oligosaccaridi del latte umano). Il DNA verrà estratto dal latte materno di tutti i soggetti, seguito dalla generazione di ampliconi PCR utilizzando primer universali 16s RNA, purificazione e quantificazione dei prodotti PCR. Il sequenziamento Illumina Miseq sarà quindi effettuato su frammenti di geni 16S rRNA per individuo. I batteriofagi sono importanti regolatori della composizione del microbioma e svolgono un ruolo chiave nel mantenere l'equilibrio appropriato dell'ecosistema del latte tra predatore e preda. Il batteriofago sarà isolato dal latte materno ai fini del sequenziamento metagenomico indipendente dalla sequenza. I batteriofagi associati alle immunoglobuline saranno isolati e sequenziati in modo simile. A causa della grande quantità di dati generati da questa tecnologia, la successiva analisi bioinformatica e statistica è essenziale. L'analisi bioinformatica sarà la stessa descritta in precedenza per gli altri campioni biologici.

Tutti i metodi analitici saranno aggiornati in modo appropriato in conformità con la metodologia più avanzata.

Conservazione dei campioni Tutti i campioni materni saranno raccolti immediatamente dal ricercatore e congelati in loco a -20°C fino a quando non potranno essere trasportati al laboratorio esterno presso APC Microbiome Ireland per l'elaborazione il prima possibile e il congelamento per la conservazione.

Tutti i campioni di neonati ottenuti in terapia intensiva neonatale saranno conservati nel congelatore di ricerca fino a quando non potranno essere trasportati al laboratorio esterno presso APC Microbiome Ireland per l'elaborazione il prima possibile e il congelamento per la conservazione.

Analisi bioinformatica L'analisi bioinformatica comporterà quanto segue, le letture paired-end da 300 bp saranno assemblate utilizzando FLASH e la suite di strumenti QIIME verrà utilizzata per l'ulteriore elaborazione delle letture paired-end, incluso il filtraggio della qualità e la rimozione di codici a barre non corrispondenti e sequenze inferiori alla lunghezza soglie. Le sequenze OTU saranno allineate usando PyNAST e il database SILVA SSURef sarà usato per determinare la tassonomia. Le diversità alfa e beta saranno calcolate utilizzando QIIME. Infine, verranno utilizzati grafici di analisi delle coordinate principali (PCoA) per visualizzare le differenze nella diversità beta basate sulle matrici di distanza UniFrac.

Endpoint primario L'endpoint primario dello studio sarà la valutazione a 24 mesi dell'ultimo partecipante arruolato. Lo studio mira ad arruolare 80-100 bambini nati prima delle 32 settimane di gestazione per un periodo di 18 mesi. Le analisi verranno eseguite dai primi campioni dopo la nascita per rilevare i primi colonizzatori esistenti dell'intestino infantile (probabilmente attraverso la trasmissione verticale) e determinare i modelli di costituzione del microbioma in questi neonati prematuri.

Procedure regolamentari e amministrative Lo studio sarà condotto in conformità con la versione Fortaleza, Brasile, ottobre 2013 della Dichiarazione di Helsinki 1964. Il Protocollo e il Foglio informativo per i partecipanti/ICF saranno approvati dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica dei Cork Teaching Hospitals.

Informazioni sui partecipanti/Consenso informato Il modulo di consenso informato utilizzato in questo studio e qualsiasi modifica apportata durante lo studio sono stati approvati in modo prospettico dal Comitato etico della ricerca clinica dei Cork Teaching Hospitals prima dell'uso. Ogni modulo di consenso informato includerà tutti gli elementi pertinenti attualmente richiesti dalla linea guida ICH E6 per la buona pratica clinica (GCP) e dal Data Protection Act del 1988 e 2003 e dal GDPR dal 25 maggio 2018.

I partecipanti possono ritirarsi dalla partecipazione allo studio in qualsiasi momento senza pregiudizio. Inoltre, lo sperimentatore può ritirare i partecipanti dallo studio se è nel migliore interesse del partecipante. Il motivo del ritiro dei partecipanti dallo studio sarà documentato nelle note del caso dei partecipanti.

GCP e conservazione dei record Lo studio sarà gestito e condotto secondo le ultime linee guida della Conferenza internazionale sull'armonizzazione (ICH) per la buona pratica clinica (GCP). Lo sperimentatore eseguirà o supervisionerà direttamente l'esecuzione di tutti i servizi descritti nel presente documento, o accessori a quelli descritti nel presente documento, in conformità ai più elevati standard della pratica della ricerca medica e clinica. L'uso e l'archiviazione dei dati raccolti durante questo studio saranno conformi al Regolamento generale sulla protezione dei dati (GDPR) (Regolamento (UE) 2016/679 del Parlamento europeo e del Consiglio) e al Data Protection Act 2018 (Sezione 36(2) ) (Ricerca Sanitaria) Regolamento 2018.