Mikrobiometablering hos præmature spædbørn (PIMENTO)

Tidligere udført arbejde har identificeret flere faktorer forbundet med ændringer i det neonatale tarmmikrobiom. Disse omfatter gestationsalder, leveringsmåde, eksponering for antibiotika og fodervalg. Mødre til spædbørn med meget lav fødselsvægt opfordres typisk til at udpumpe modermælk til deres baby. Dette er forbundet med lavere forekomst af sepsis og nekrotiserende enterocolitis. Nogle af disse virkninger kan være relateret til bakterierne modtaget i modermælk fra deres mor. Korrelationer mellem ændringer i det neonatale tarmmikrobiom og mikrobiotaen i den mælk, de bliver fodret med, er begrænset. Desuden er virkningen af ​​frysning (dvs. standard praksis for opbevaring af modermælk) på modermælksmikrobiota ikke blevet velkarakteriseret. Ydermere, i mangel af Mother's Own Milk (MOM) er det klinisk hensigtsmæssigt at tilbyde Donor Human Milk, hvor den yderligere pasteuriseringsproces også kan påvirke de bakteriestammer, der er til stede deri, og føre til et ændret mønster af kolonisering af neonataltarmen.

Dette er en prospektiv observationsundersøgelse, som vil evaluere etableringen og udviklingen af ​​tarmmikrobiomet hos meget for tidligt fødte spædbørn ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker. Data vil blive analyseret ved hjælp af bioinformatik til at vurdere vertikal transmission fra mor til spædbarn in utero, etablering og udvikling af præmature spædbørns mikrobiom og evaluere, hvordan ledelsesstrategier for neonatale intensive plejeafdelinger (NICU) ændrer mikrobiomets sammensætning og genopretning efter interventioner. Dette arbejde vil give detaljerede oplysninger, som kan danne grundlag for udvikling af individualiserede probiotika til meget for tidligt fødte spædbørn og kan hjælpe med at udvikle mikrobiombeskyttende håndteringsstrategier for NICU.

Rekruttering og samtykkeproces Gravide vil blive kontaktet, hvis der er mulighed for levering før 32 ugers graviditet. En deltagerinformationsfolder vil blive udleveret, som beskriver formålet med undersøgelsen, og hvad der forventes af deltagerne. Undersøgelsen vil også blive forklaret af en forsker. Spørgsmål vil blive besvaret, og der vil blive givet tilstrækkelig tid til overvejelse. Hvis de ønsker at deltage med deres spædbarn, skal de formodet kvalificerede deltagere underskrive den informerede samtykkeformular (ICF). De vil modtage en kopi af den underskrevne samtykkeerklæring. Udskudt samtykke vil være tilladt, men eventuelle spædbørnsprøver, der indsamles, vil blive opbevaret på stedet og vil ikke blive behandlet, før samtykke er opnået. Hvis samtykke afvises, vil alle indsamlede prøver blive kasseret med det samme.

Inklusions-/eksklusionskriterier vil blive vurderet på alle tidspunkter fra screening til informeret samtykke til fødslen af ​​spædbarnet. Deltagerne kan trækkes ud af undersøgelsen, hvis eksklusionskriterierne er opfyldt postnatalt. For inklusions-/udelukkelseskriterier se afsnit 4.1/4.2. Flere fødsler vil blive tilmeldt separat. Prøver vil blive indsamlet fra hvert spædbarn, men der vil kun blive indsamlet ét sæt af moderprøver. I tilfælde af, at den ene tvilling fødes vaginalt og den anden med kejsersnit, vil både hud og vaginale podninger blive indsamlet fra moderen, hvis det er muligt.

Oplysninger om demografi, levering, auxologi, fodring, antibiotika og komorbiditeter vil blive indsamlet fra deltagerne. Derudover vil en Bayley-skala for spædbørns og småbørns udvikling blive udført ved 2 års alderen for at vurdere neuroudvikling.

Samling af prøver

Spædbørnsprøver

Meconium- og afføringsprøver Afføringsprøver vil blive udført ved hyggen. Rektale podninger, udført af den indlagte kliniske sygeplejerske, tages rutinemæssigt ved indlæggelse på NICU. En ekstra podning vil blive taget til mikrobiomanalyse på dette tidspunkt. Under den neonatale indlæggelse udtages en prøve af det først passerede meconium fra bleen, og derefter vil der blive udtaget afføring fra spædbarnets ble hver anden uge, hvis det er muligt, under rutinepleje.

Spædbarnsurin Under indlæggelsen vil urinen blive opsamlet ugentligt af neonatalsygeplejersken ved at placere en steril pude/podepinde i spædbarnets ble, som derefter fjernes ved næste forekomst af rutinepleje.

Spædbarnsblod Blodprøver vil kun blive indsamlet på tidspunktet for venepunktur af en klinisk indiceret årsag. Venepunktur og prøvetagning vil blive udført af det kliniske team. Ikke mere end 1 % af et spædbarns estimerede totale blodvolumen (eTBV) (80 ml/kg) vil blive indsamlet på noget tidspunkt til forskningsformål (eTBV=80 ml/kg). Tidspunkter for blodprøvetagning vil være inden for den første uge af livet (dvs. før etablering af fodring), mellem 2 og 4 uger af livet (dvs. når enteral ernæring er fuldt etableret), og før udskrivning. Venepunktur udelukkende med det formål at indsamle en forskningsprøve er ikke tilladt.

Maternelle prøver

Orale podninger Orale prøver vil blive indsamlet af forskningssygeplejersken/investigator så hurtigt som muligt efter fødslen fra moderen ved hjælp af en steril podning.

Vaginal podning (vaginale fødsler) En vaginal podning vil blive indsamlet hos moderen af ​​den behandlende jordemoder eller fødselslæge i fødegangen eller af moderen selv på postnatal afdeling.

Hudpodning (fødsler ved kejsersnit) En hudpodning vil blive anskaffet fra moderen af ​​forskningssygeplejersken/investigator efter fødslen. Det vil blive indsamlet fra det indre aspekt af håndleddet under deltagerens hospitalsarmbånd.

Maternelle afføringsprøver Deltagerne vil blive forsynet med kits og instruktioner til at indsamle afføringsprøver. Prøver vil blive frosset, så snart de leveres og indsamles af forskerholdet.

Modermælk Modermælksprøver af MOM vil blive indsamlet fra mødre under hele undersøgelsen. Mødre vil blive bedt om at give en 5-15 ml modermælksprøve (hvis det er muligt) hver anden uge, mens deres spædbarn er på NICU, hvis hun har tilstrækkelig forsyning.

Prøveanalyse

Analyse for spædbarns afføring High-throughput screening af heterologt udtrykt metagenomisk DNA vil blive undersøgt som et middel til at se på funktionaliteten f.eks. overordnet evne til at metabolisere visse kulhydratkilder (dvs. modermælk). DNA vil blive ekstraheret fra fæces fra alle spædbørn efterfulgt af generering af PCR-amplikoner ved brug af universelle 16s RNA-primere, oprensning og kvantificering af PCR-produkter. Illumina Miseq-sekventering vil derefter blive udført på 16S rRNA-genfragmenter pr. individ. På grund af den store mængde data, der genereres fra denne teknologi, er efterfølgende bioinformatiske og statistiske analyser afgørende.

Analyse for spædbarnsurin Ikke-målrettede LC-MS-assays vil blive udført med et hybrid lineært ionfælde Fourier Transform (LTQ FT) Orbitrap massespektrometer. XCMS Online-portalen (https://xcmsonline.scripps.edu/) vil blive brugt til databehandling (alignment, peak picking, nul peak re-integrationer, funktionsgruppering og vurdering af kvalitetskontrolprøver). For at kommentere forbindelser vil der blive brugt en udvælgelsesstrategi baseret på de mest udbredte og de mest statistisk signifikante egenskaber. For at hjælpe med at identificere metabolitter vil der blive udført en yderligere klyngeanalyse ved brug af Spearman korrelationsanalyse.

Analyse for spædbarnsblod Blodprøver vil blive undersøgt i forhold til funktionel metabolomics, herunder, men ikke begrænset til, analyse ved brug af haglgeværmetabolomics og sammenligning med datasættene med høj gennemstrømning af afføringsmikrobiomet på samme tidspunkt, hvor der søges efter relationer til kendte mikrobielle signalgrupper.

Analyse af maternelle prøver Den peri-partum orale, vaginale og hudmikrobielle sammensætning, i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data, vil blive analyseret. Sammenligning vil blive foretaget mellem maternelle mikrobiotaprofiler med tidligere undersøgelser, og data vil blive undersøgt med de tidlige spædbarns tarmmikrobiomdata for at vurdere den vertikale og horisontale overførsel af mikroorganismer i moder-spædbarnsoverførsel. DNA vil blive ekstraheret fra prøver, efterfulgt af generering af PCR-amplikoner ved brug af universelle 16s RNA-primere, oprensning og kvantificering af PCR-produkter. Illumina Miseq-sekventering vil derefter blive udført på 16S rRNA-genfragmenter pr. individ. På grund af den store mængde data, der genereres fra denne teknologi, er efterfølgende bioinformatiske og statistiske analyser afgørende.

Afføringens mikrobiotasammensætning vil blive analyseret for deres mikrobielle indhold af efterforskerne ved hjælp af avancerede metoder, muligvis inklusive, men ikke begrænset til, sekventering og kvantitativ PCR.

Forskerne vil analysere moderens fækale mikrobielle sammensætning og det fækale mikrobielle metagenom i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data. Fækale mikrobielle sammensætningssekvenser vil afsløre, hvilke bakterietyper der er til stede, og metagenomiske analyser vil indikere det metaboliske potentiale af den mikrobielle belastning. Vi foreslår at bruge high-throughput screening af heterologt udtrykt metagenomisk DNA som et middel til at se på funktionaliteten af ​​forskellige populationer, f.eks. overordnet evne til at omsætte visse kulhydratkilder, omdannelse af toksiner mm. DNA vil blive ekstraheret fra moderens afføring som skitseret for spædbarnets afføring.

Analyse for modermælk Forskerne vil analysere mælkens mikrobielle sammensætning og mikrobielle metagenom i forbindelse med generelle kliniske og demografiske data. Bakterieprofiler vil blive sammenlignet med tidligere undersøgelser, der er rapporteret om moderens tarmmikrobiom og korrelere dataene med spædbarnets afføringsmikrobiomdata for at vurdere horisontal overførsel af mikroorganismer ved moder-spædbarnsoverførsel. High-throughput screening af heterologt udtrykt metagenomisk DNA vil blive brugt som et middel til at se på funktionaliteten f.eks. overordnet evne til at metabolisere visse kulhydratkilder (f. oligosaccharider i modermælk). DNA vil blive ekstraheret fra modermælken fra alle forsøgspersoner, efterfulgt af generering af PCR-amplikoner ved hjælp af universelle 16s RNA-primere, oprensning og kvantificering af PCR-produkter. Illumina Miseq-sekventering vil derefter blive udført på 16S rRNA-genfragmenter pr. individ. Bakteriofager er vigtige regulatorer af mikrobiomsammensætning og spiller en nøglerolle i at opretholde den passende ligevægt mellem rovdyr og bytte i mælkeøkosystemet. Bakteriofager vil blive isoleret fra human mælk med henblik på sekvensuafhængig metagenomisk sekventering. De bakteriofager, der er forbundet med immunoglobuliner, vil på lignende måde blive isoleret og sekventeret. På grund af den store mængde data, der genereres fra denne teknologi, er efterfølgende bioinformatiske og statistiske analyser afgørende. Bioinformatisk analyse vil være den samme som tidligere nævnt for de øvrige biologiske prøver.

Alle analysemetoder vil blive opdateret efter behov i overensstemmelse med den nyeste metode.

Prøveopbevaring Alle maternelle prøver vil straks blive indsamlet af forskeren og frosset på stedet ved -20°C, indtil de kan transporteres til off-site laboratoriet hos APC Microbiome Ireland til behandling så hurtigt som muligt og nedfrysning til opbevaring.

Alle spædbørnsprøver opnået i NICU vil blive opbevaret i forskningsfryseren, indtil de kan transporteres til off-site laboratoriet på APC Microbiome Ireland til behandling så hurtigt som muligt og nedfrysning til opbevaring.

Bioinformatisk analyse Bioinformatisk analyse vil involvere følgende, 300 bp parrede ende-aflæsninger vil blive samlet ved hjælp af FLASH, og QIIME-værktøjspakken vil blive brugt til yderligere behandling af par-ende-læsninger, herunder kvalitetsfiltrering og fjernelse af uoverensstemmende stregkoder og sekvenser under længden tærskler. OTU-sekvenser vil blive justeret ved hjælp af PyNAST, og SILVA SSURef-databasen vil blive brugt til at bestemme taksonomi. Alfa- og beta-diversiteter vil blive beregnet ved hjælp af QIIME. Endelig vil principal koordinatanalyse (PCoA) plots blive brugt til at visualisere forskelle i beta-diversitet baseret på UniFrac-afstandsmatricer.

Primært endepunkt Det primære endepunkt for undersøgelsen vil være 24-måneders vurdering af den sidst tilmeldte deltager. Undersøgelsen sigter mod at indskrive 80-100 spædbørn født før 32 ugers svangerskab over en 18-måneders periode. Analyser vil blive udført fra de første prøver efter fødslen for at påvise eksisterende, tidlige kolonisatorer af spædbarnets tarm (sandsynligvis gennem vertikal transmission) og bestemme mønstre for mikrobiometablering hos disse præmature spædbørn.

Regulatoriske og administrative procedurer Undersøgelsen vil blive udført i overensstemmelse med versionen Fortaleza, Brasilien, oktober 2013 af Helsinki-erklæringen 1964. Protokollen og deltagerinformationsfolderen/ICF vil blive godkendt af den kliniske forskningsetiske komité på Cork Teaching Hospitals.

Deltagerinformation/Informeret samtykke Formularen til informeret samtykke, der anvendes i denne undersøgelse, og eventuelle ændringer foretaget i løbet af undersøgelsen, er prospektivt godkendt af den kliniske forskningsetiske komité på Cork Teaching Hospitals før brug. Hver informeret samtykkeformular vil omfatte alle relevante elementer, der i øjeblikket kræves af ICH E6 Guideline for Good Clinical Practice (GCP) og Data Protection Act af 1988 og 2003, og GDPR fra 25. maj 2018.

Deltagerne kan til enhver tid trække sig fra deltagelse i undersøgelsen uden skade. Derudover kan investigator trække deltagere ud af undersøgelsen, hvis det er i deltagerens bedste interesse. Årsagen til, at deltagerne trækker sig fra undersøgelsen, vil blive dokumenteret i deltagernes casenotater.

GCP og journalopbevaring Undersøgelsen vil blive styret og udført i henhold til de seneste retningslinjer for international harmonisering (ICH) for god klinisk praksis (GCP). Investigatoren vil udføre eller direkte overvåge udførelsen af ​​alle de tjenester, der er beskrevet heri, eller i forbindelse med dem, der er beskrevet heri, i overensstemmelse med de højeste standarder for medicinsk og klinisk forskningspraksis. Brug og opbevaring af data indsamlet i løbet af denne undersøgelse vil være i overensstemmelse med den generelle databeskyttelsesforordning (GDPR) (Europa-Parlamentets og Rådets forordning (EU) 2016/679) og databeskyttelsesloven 2018 (afsnit 36, stk. 2). ) (Sundhedsforskning) forordninger 2018.