Mikrobiomin muodostuminen keskosilla (PIMENTO)

Aikaisemmin tehty työ on tunnistanut useita tekijöitä, jotka liittyvät muutoksiin vastasyntyneen suoliston mikrobiomissa. Näitä ovat raskausaika, synnytystapa, altistuminen antibiooteille ja ruokintavalinta. Hyvin alhaisen syntymäpainon äitejä kannustetaan tyypillisesti lypsämään rintamaitoa vauvalleen. Tämä liittyy alhaisempiin sepsiksen ja nekrotisoivan enterokoliitin määrään. Jotkut näistä vaikutuksista voivat liittyä bakteereihin, jotka ovat saaneet äidiltään äidinmaitoon. Vastasyntyneen suoliston mikrobiomin muutosten ja heidän ruokittavan maidon mikrobiotan väliset korrelaatiot ovat rajalliset. Lisäksi pakastamisen (eli normaalin rintamaidon säilytyskäytännön) vaikutusta äidinmaidon mikrobiotaan ei ole kuvattu hyvin. Lisäksi äidin oman maidon (MOM) puuttuessa on kliinisesti tarkoituksenmukaista tarjota ihmisluovuttajamaitoa, jossa lisäpastörointiprosessi voi myös vaikuttaa siinä oleviin bakteerikantoihin ja johtaa vastasyntyneen suoliston kolonisaatiomallin muuttumiseen.

Tämä on tulevaisuuden havainnointitutkimus, jossa arvioidaan hyvin keskosten suoliston mikrobiomin muodostumista ja kehitystä seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoilla. Tiedot analysoidaan bioinformatiikan avulla pystysuoran siirtymisen arvioimiseksi äidiltä lapselle kohdussa, keskosen mikrobiomin muodostumista ja kehittymistä sekä sitä, kuinka vastasyntyneiden tehohoitoyksikön (NICU) hallintastrategiat muuttavat mikrobiomin koostumusta ja toipumista interventioiden jälkeen. Tämä työ tarjoaa yksityiskohtaista tietoa, joka voi tarjota perustan yksilöllisten probioottien kehittämiselle hyvin keskosille ja voi auttaa kehittämään mikrobiomia suojaavia hallintastrategioita NICU:lle.

Rekrytointi- ja suostumusprosessi Raskaana olevia naisia ​​lähestytään, jos synnytys on mahdollista ennen 32 raskausviikkoa. Osallistujille toimitetaan tiedote, jossa selvitetään tutkimuksen tarkoitus ja mitä osallistujilta odotetaan. Tutkimusta selittää myös tutkija. Kysymyksiin vastataan ja pohdiskeluaikaa on riittävästi. Jos he haluavat osallistua lapsensa kanssa, oletettavasti kelpoisten osallistujien on allekirjoitettava tietoinen suostumuslomake (ICF). He saavat kopion allekirjoitetusta suostumuslomakkeesta. Lykätty suostumus sallitaan, mutta kaikki kerätyt pikkulasten näytteet säilytetään paikan päällä, eikä niitä käsitellä ennen suostumuksen saamista. Jos suostumus evätään, kaikki kerätyt näytteet hylätään välittömästi.

Sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit arvioidaan kaikkina ajankohtina seulonnasta tietoiseen suostumukseen lapsen synnyttämiseen asti. Osallistujat voidaan poistaa tutkimuksesta, jos poissulkemiskriteerit täyttyvät synnytyksen jälkeen. Katso sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit kohdista 4.1/4.2. Useita synnytyksiä rekisteröidään erikseen. Näytteitä kerätään jokaisesta lapsesta, mutta vain yksi sarja äidin näytteitä otetaan. Jos toinen kaksos syntyy emättimen kautta ja toinen keisarileikkauksella, äidiltä otetaan mahdollisuuksien mukaan vanupuikkoja iholta ja emättimestä.

Osallistujilta kerätään tietoa väestötiedoista, synnytyksestä, auksologiasta, ruokinnasta, antibiooteista ja liitännäissairauksista. Lisäksi vauvojen ja taaperoiden kehitystä koskeva Bayley-asteikko suoritetaan 2-vuotiaana hermoston kehityksen arvioimiseksi.

Näytekokoelma

Pikkulasten näytteet

Mekonium- ja ulostenäytteet Ulostenäytteet otetaan sängyn puolella. Rektaaliset pyyhkäisynäytteet, jotka hakeutuva kliininen sairaanhoitaja ottaa, otetaan rutiininomaisesti NICU:lle saapumisen yhteydessä. Tässä vaiheessa otetaan ylimääräinen vanupuikko mikrobiomianalyysiä varten. Vastasyntyneen vastaanoton yhteydessä vaipasta otetaan näyte ensimmäisestä läpäisystä mekoniumista ja sen jälkeen vauvan vaipasta otetaan ulostenäytteet mahdollisuuksien mukaan joka toinen viikko rutiinihoidon yhteydessä.

Vauvan virtsa Potilashoidon aikana vastasyntyneiden sairaanhoitaja kerää virtsan viikoittain asettamalla steriilin tyynyn/puikkoja vauvan vaippaan, joka poistetaan seuraavan rutiinihoidon yhteydessä.

Vauvan veri Verinäytteitä otetaan vain venepunktion yhteydessä kliinisesti perustellusta syystä. Suonenpunktion ja näytteenoton suorittaa kliininen tiimi. Enintään 1 % vauvan arvioidusta kokonaisveritilavuudesta (eTBV) (80 ml/kg) kerätään kerrallaan tutkimustarkoituksiin (eTBV = 80 ml/kg). Verinäytteenottoajankohta on ensimmäisen elinviikon sisällä (ts. ennen ruokinnan aloittamista) 2-4 elinviikkoa (ts. kun enteraalinen ruokinta on täysin vakiintunut) ja ennen kotiutumista. Suonenpunktio, jonka tarkoituksena on yksinomaan tutkimusnäytteen kerääminen, ei ole sallittu.

Äidin näytteet

Suupuikkot Tutkimushoitaja/tutkija ottaa suunäytteet äidiltä mahdollisimman pian syntymän jälkeen steriilillä vanupuikolla.

Vanupuikko emättimestä (emätinsynnytykset) Emätinnäppäimen ottaa äidiltä hoitava kätilö tai synnytyslääkäri synnytysosastolla tai äiti itse postnataalisella osastolla.

Ihopuikko (keisarileikkauksen toimitukset) Tutkimussairaanhoitaja/tutkija ottaa äidiltä vanupuikon synnytyksen jälkeen. Se kerätään ranteen sisäpuolelta osallistujan sairaalarannekkeen alle.

Äitien ulostenäytteet Osallistujille toimitetaan sarjat ja ohjeet ulostenäytteiden keräämiseksi. Näytteet jäädytetään heti, kun tutkimusryhmä toimittaa ja kerää ne.

Äidinmaito MOM:n rintamaitonäytteitä kerätään äideiltä koko tutkimuksen ajan. Äitejä pyydetään toimittamaan 5-15 ml rintamaitonäyte (jos mahdollista) kahden viikon välein, kun heidän vauvansa on NICU:ssa, jos hänellä on riittävä tarjonta.

Näytteen analyysi

Analyysi pikkulasten ulosteelle Heterologisesti ilmentyneen metagenomisen DNA:n suuritehoinen seulonta tutkitaan keinona tarkastella toiminnallisuutta esim. yleinen kyky metaboloida tiettyjä hiilihydraattilähteitä (esim. rintamaito). DNA uutetaan kaikkien pikkulasten ulosteista, minkä jälkeen muodostetaan PCR-amplikonit käyttämällä universaaleja 16s RNA-alukkeita, puhdistetaan ja määritetään PCR-tuotteet. Illumina Miseq -sekvensointi suoritetaan sitten 16S rRNA -geenifragmenteille yksilöä kohti. Koska tästä tekniikasta syntyy valtava määrä dataa, myöhempi bioinformaattinen ja tilastollinen analyysi on välttämätöntä.

Imeväisten virtsan analyysi Kohdistamattomat LC-MS-määritykset suoritetaan hybridi lineaarisen ioniloukun Fourier Transform (LTQ FT) Orbittrap-massaspektrometrillä. XCMS Online -portaali (https://xcmsonline.scripps.edu/) käytetään tietojen käsittelyyn (kohdistus, huippujen poiminta, nollahuippujen uudelleenintegroinnit, ominaisuuksien ryhmittely ja laadunvalvontanäytteiden arviointi). Yhdisteiden merkitsemiseen käytetään valintastrategiaa, joka perustuu runsaimpiin ja tilastollisesti merkittävimpiin ominaisuuksiin. Metaboliittien tunnistamisen helpottamiseksi suoritetaan ylimääräinen klusterointianalyysi käyttämällä Spearman-korrelaatioanalyysiä.

Imeväisten veren analyysi Verinäytteitä tutkitaan suhteessa funktionaaliseen metabolomiikkaan, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, analyysi haulikkometabolomiikkaa käyttäen ja vertailu ulosteen mikrobiomin korkean suorituskyvyn tietokokonaisuuksiin, samalla kun etsitään yhteyksiä tunnettuihin mikrobien signalointiryhmiin.

Äidin näytteiden analyysi Synnytyksen jälkeinen suun, emättimen ja ihon mikrobikoostumus analysoidaan yhdessä yleisten kliinisten ja demografisten tietojen kanssa. Äidin mikrobiotaprofiileja verrataan aikaisempiin tutkimuksiin ja tietoja tarkastellaan varhaisen lapsen suoliston mikrobiomitiedoilla mikro-organismien vertikaalisen ja horisontaalisen siirtymisen arvioimiseksi äidin ja lapsen välisessä tartunnassa. DNA uutetaan näytteistä, mitä seuraa PCR-amplikonien generointi käyttämällä universaaleja 16s RNA-alukkeita, PCR-tuotteiden puhdistus ja kvantifiointi. Illumina Miseq -sekvensointi suoritetaan sitten 16S rRNA -geenifragmenteille yksilöä kohti. Koska tästä tekniikasta syntyy valtava määrä dataa, myöhempi bioinformaattinen ja tilastollinen analyysi on välttämätöntä.

Tutkijat analysoivat ulosteen mikrobioottisen koostumuksen niiden mikrobisisällön suhteen käyttämällä viimeisimpiä menetelmiä, mukaan lukien, mutta niihin rajoittumatta, sekvensointi ja kvantitatiivinen PCR.

Tutkijat analysoivat äidin ulosteen mikrobikoostumuksen ja ulosteen mikrobien metagenomin yleisten kliinisten ja demografisten tietojen yhteydessä. Ulosteen mikrobikoostumussekvenssit paljastavat, mitä bakteerityyppejä esiintyy, ja metagenomiset analyysit osoittavat mikrobikuorman metabolisen potentiaalin. Ehdotamme heterologisesti ilmentyneen metagenomisen DNA:n korkean suorituskyvyn seulonnan käyttöä keinona tarkastella eri populaatioiden toimivuutta esim. yleinen kyky metaboloida tiettyjä hiilihydraattilähteitä, toksiinien transformaatio jne. DNA uutetaan äidin ulosteesta, kuten on kuvattu vauvan ulosteessa.

Rintamaidon analyysi Tutkijat analysoivat maidon mikrobikoostumusta ja mikrobien metagenomia yleisten kliinisten ja demografisten tietojen yhteydessä. Bakteeriprofiileja verrataan aikaisempiin äidin suoliston mikrobiomista raportoituihin tutkimuksiin, ja tiedot korreloidaan vauvan ulosteen mikrobiomitietoihin, jotta voidaan arvioida mikro-organismien horisontaalista siirtymistä äidin ja lapsen välisessä tartunnassa. Heterologisesti ilmennetyn metagenomisen DNA:n suuritehoista seulontaa käytetään keinona tarkastella toiminnallisuutta esim. yleinen kyky metaboloida tiettyjä hiilihydraattilähteitä (esim. äidinmaidon oligosakkaridit). DNA uutetaan kaikkien koehenkilöiden rintamaidosta, mitä seuraa PCR-amplikonien generointi käyttämällä universaaleja 16s RNA-alukkeita, PCR-tuotteiden puhdistus ja kvantifiointi. Illumina Miseq -sekvensointi suoritetaan sitten 16S rRNA -geenifragmenteille yksilöä kohti. Bakteriofagit ovat tärkeitä mikrobiomikoostumuksen säätelijöitä ja niillä on keskeinen rooli sopivan maitoekosysteemin tasapainon ylläpitämisessä petoeläimen ja saaliin välillä. Bakteriofagi eristetään äidinmaidosta sekvenssiriippumatonta metagenomista sekvensointia varten. Ne immunoglobuliineihin liittyvät bakteriofagit eristetään ja sekvensoidaan samalla tavalla. Koska tästä tekniikasta syntyy valtava määrä dataa, myöhempi bioinformaattinen ja tilastollinen analyysi on välttämätöntä. Bioinformaattinen analyysi on sama kuin aiemmin muiden biologisten näytteiden kohdalla.

Kaikki analyyttiset menetelmät päivitetään tarvittaessa uusimman tekniikan mukaisesti.

Näytteiden säilytys Tutkija kerää välittömästi kaikki äidin näytteet ja pakastetaan paikan päällä -20 °C:seen, kunnes ne voidaan kuljettaa APC Microbiome Irelandin ulkopuoliseen laboratorioon käsittelyä varten mahdollisimman pian ja pakastettaviksi varastointia varten.

Kaikki NICU:ssa saadut pikkulasten näytteet säilytetään tutkimuspakastimessa, kunnes ne voidaan kuljettaa APC Microbiome Irelandin ulkopuoliseen laboratorioon käsittelyä varten mahdollisimman pian ja pakastettaviksi varastointia varten.

Bioinformaattinen analyysi Bioinformaattiseen analyysiin kuuluu seuraavat: 300 bp:n parillisen pään lukemat kootaan FLASHilla ja QIIME-työkalusarjaa käytetään parillisen pään lukujen jatkokäsittelyyn, mukaan lukien laatusuodatus ja yhteensopimattomien viivakoodien ja pituuden alapuolella olevien sekvenssien poistaminen kynnysarvot. OTU-sekvenssit kohdistetaan PyNASTin avulla ja taksonomian määrittämiseen käytetään SILVA SSURef -tietokantaa. Alfa- ja beta-diversiteetit lasketaan QIIME:n avulla. Lopuksi pääkoordinaattianalyysin (PCoA) käyriä käytetään visualisoimaan eroja beeta-diversiteetissä UniFrac-etäisyysmatriisien perusteella.

Ensisijainen päätepiste Tutkimuksen ensisijainen päätetapahtuma on viimeisen ilmoittautuneen osallistujan 24 kuukauden arviointi. Tutkimuksen tavoitteena on ottaa mukaan 80 - 100 ennen 32 raskausviikkoa syntyneitä vauvaa 18 kuukauden ajanjaksolle. Analyysit suoritetaan ensimmäisistä syntymän jälkeisistä näytteistä, jotta voidaan havaita olemassa olevat, varhaiset imeväisten suoliston kolonisaattorit (todennäköisesti pystysuoran leviämisen kautta) ja määrittää mikrobiomien muodostumismallit näissä keskosissa.

Sääntely- ja hallintomenettelyt Tutkimus suoritetaan vuoden 1964 Helsingin julistuksen Fortaleza, Brasilia, lokakuu 2013 version mukaisesti. Protokollan ja osallistujan tiedotteen/ICF:n hyväksyy Corkin opetussairaaloiden kliinisen tutkimuksen eettinen komitea.

Osallistujatiedot / Tietoinen suostumus Tässä tutkimuksessa käytetty tietoinen suostumuslomake ja kaikki tutkimuksen aikana tehdyt muutokset on hyväksytty Corkin opetussairaaloiden kliinisen tutkimuksen eettisen komitean toimesta ennen käyttöä. Jokainen tietoinen suostumuslomake sisältää kaikki asiaankuuluvat elementit, joita tällä hetkellä vaaditaan ICH E6 Guideline for Good Clinical Practice (GCP) ja Data Protection Act of 1988 and 2003 sekä GDPR 25. toukokuuta 2018 alkaen.

Osallistujat voivat peruuttaa osallistumisen tutkimukseen milloin tahansa ilman haittaa. Lisäksi tutkija voi poistaa osallistujat tutkimuksesta, jos se on osallistujan edun mukaista. Syy osallistujien tutkimuksesta vetäytymiseen dokumentoidaan osallistujien tapausmuistiinpanoihin.

GCP ja tietueiden säilyttäminen Tutkimusta hallinnoidaan ja suoritetaan viimeisimpien kansainvälisen harmonisointikonferenssin (ICH) hyvän kliinisen käytännön (GCP) ohjeiden mukaisesti. Tutkija suorittaa tai valvoo suoraan kaikkien tässä kuvattujen tai tässä kuvattuihin liittyvien palvelujen suorittamista korkeimpien lääketieteellisen ja kliinisen tutkimuksen standardien mukaisesti. Tämän tutkimuksen aikana kerättyjen tietojen käyttö ja säilyttäminen noudattaa yleistä tietosuoja-asetusta (GDPR) (Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EU) 2016/679) ja vuoden 2018 tietosuojalakia (36 §:n 2 momentti). ) (Terveystutkimuksen) määräykset 2018.