GH後の成長プレートマーカーとしてのmiRNA

はじめに 組換えヒト成長ホルモン (GH) を治療に使用した臨床経験により、承認された各適応症で治療を受けた患者の大多数で適切な成長反応が見られました。 しかし、さまざまな治療計画で経験が蓄積されると、個別の治療計画であっても、1 年目の身長の反応はかなり異なることが認識されました (1)。 短期的な反応が悪いことは、成人時の身長の伸びが不十分になることにもつながります (2)。

個々の患者の成長反応を予測するために、いくつかの数学モデルが開発されました。 大規模な Pfizer International Growth Database (KIGS) データベースから得られた予測モデルは、GHD 患者における GH 療法に対する反応のばらつきの約 60% を説明します (3)。 このようなモデルは、定義可能な応答性の変動を考慮しており、臨床医が個々の患者に合わせて GH 投与量を調整できるようにします。 重回帰分析に基づいて、これらのモデルは、実年齢、挑発的検査中のGHピーク、GH線量、出生時体重SDS、目標身長SDSに対して調整された身長SDSなど、成長（主に1年目の成長速度）と相関する要因を特定しました（ 3)。 ベースライン IGF-I やレプチンなどの生化学変数も予測モデルに追加されています。

エクソン3欠失成長ホルモン受容体多型、IGFBP3多型など、GH治療に対する良好な反応者と悪い反応者を識別する試みにも遺伝子マーカーが使用されましたが、それらの結果は異なる研究で矛盾していました。

マイクロRNA (miRNA) は、遺伝子発現を制御する小さな非コードRNAです。 ヒトゲノム内のほとんどの遺伝子は、1 つ以上の miRNA によって制御されています (4)。 miRNA は遺伝子発現を調節する能力があるため、ヒトの病気だけでなく、病態生理学や生理学的プロセスの進行において重要な役割を果たしていると考えられます (5)。 マイクロRNAは通常、mRNAの3'UTRドメインに結合することによって遺伝子発現を抑制し(6)、そのためmRNAの分解を増加させたり、翻訳情報やタンパク質合成を妨げたりします。

miRNA の注目すべき特徴の 1 つは、エキソソーム内の血漿循環であり、エクソソームの分解に対する耐性を決定し、循環血液中での測定を可能にし、リキッドバイオプシーとして機能します (7)。

さまざまな in vitro モデルおよび動物における科学的証拠は、miRNA が軟骨内骨化の制御および視床下部-下垂体-IGF 軸の制御において重要な役割を果たしていることが示唆されています (8)。 特に、miRNA-140、322、および 22 は、成長プレートの発達に関与すると記載されています (9)。 Catellani らは、miR-22-3p、miR-30c-5p、miR-106a-5p、miR-140-5p、miR-199a-5p、miR-335-5p、miR-340-5p、および miR -494-3p は、WNT-βカテニン、Notch、PI3K/AKT、および TGFβ シグナル伝達経路への作用を通じて、縦方向の成長と骨発達の調節に関与しています (10)。

GH 治療中の患者の成長反応は、患者の基礎状態と治療に対する個々の生来の感受性の両方に応じて変化します (11)。 多くの場合、測定された成長率は予想される成長率と一致せず、臨床補助パラメータと用量および GH ピークの間の相関の程度は、治療中に個人間および個人内で大きく異なります (12)。

したがって、この研究の目的は、GH治療前および治療中に循環成長板で合成されたmiRNAを測定し、臨床マーカーおよび生化学マーカーとの相関を探索することです。

方法 ブラジルのイルマンダーデ・ダ・サンタ・カーサ・デ・ミゼリコルディア・デ・サンパウロの小児内分泌科で追跡調査を受けたGH欠損症（GHD）の男女とも小児および青少年（n:30の患者）がスクリーニング検査を受ける。 必要に応じて、すべての参加者とその保護者から書面によるインフォームドコンセントが得られます。

包含基準：下垂体後部異所性腺（ＥＰＰ）を示す磁気共鳴画像法と組み合わせた、ＧＨピーク濃度＜５ｎｇ／ｍｌを示すＧＨ刺激試験。 複合ホルモン欠乏症の患者は、研究期間中に補償されなければなりません。

除外基準：慢性疾患、長期間の生理学的超過用量のグルココルチコイドの必要性、骨年齢>14歳または>16歳（それぞれ女子および男子）、研究プロトコール中に適切なフォローアップを受けていない患者。

臨床追跡調査：各来院時の臨床記録には、年齢、体重、身長、目標身長差までの身長、および思春期の段階が含まれます。 臨床評価は、治療開始前（基礎）、GH 治療中の 1 か月後、3 か月後、6 か月後という 5 つの時点で行われます。 体格指数 (BMI) は、体重/身長² (kg/m²) として計算されます。 身長、目標身長 (TH)、および BMI は SD スコアとして表されます (WHO、2007)。 増殖速度 SDS は Tanner の参考文献 (13) を使用して計算されます。 すべての被験者の思春期は、マーシャルとタナーの基準に従って分類されます (14、15)。 骨年齢は 6 か月ごとに取得され、Greulich と Pyle (16) に従って分類されます。

臨床検査による評価: ホルモン測定は 3 か月および 6 か月後に測定され、IGF-I、空腹時血糖、インスリン、TSH、遊離 T4 が含まれます。そしてコルチゾール。 ゴナドトロピンと性ステロイドが適切であれば測定されます。 成長板で合成された miRNA の発現を評価するために、GH 治療の開始前、または短期間の休薬期間 (15 ～ 30 日) 後、および GH 治療中の 1、3、および 6 か月後に基礎血液サンプルが採取されます。

miRNA の測定: 定量的 PCR (qPCR) を使用して、循環 miRNA レベルを測定します。ドロップレット デジタル PCR (ddPCR) は、精度と感度が優れており、影響が少ないため、リキッド バイオプシーの応用におけるゴールド スタンダードと考えられています。低濃度の標的核酸分子を検出しながら、内部/外部正規化を必要としません。 全血サンプルはバキュテナー血清分離管に採取され、収集から 2 時間以内に処理され、4℃、2,000 g で 10 分間遠心分離されます。 血清を 1.5 ml の滅菌 RNase フリーチューブに等分し、さらに 2,500 g、4℃で 10 分間遠心分離して、汚染細胞および残骸を除去します。 血清はRNaseフリーの滅菌チューブに回収され、使用するまで-80℃で保存されます。 総ＲＮＡは、ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｋｉｔ（ＩＤ：２１７２０４－Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、２００μｌの血清を使用してサンプルから単離される。

次の miRNA が測定されます: miR-22-3p、miR-30c-5p、miR-106a-5p、miR-140-5p、miR-199a-5p、miR-335-5p、miR-340-5p、およびmiR-494-3p。 各 ddPCR アッセイでは、cDNA サンプル 3 μL、プローブ用 2x ddPCR スーパーミックス (Bio-Rad) 10 μL、20x TaqMan miRNA プローブ 1 μL、および RNase フリー水 6 μL を 20 μL の反応混合物に加えます。 次に、混合物とプローブ用液滴生成オイル (Bio-Rad) 70 μL を、使い捨て液滴生成カートリッジ (Bio-Rad) のサンプル ウェルとオイル ウェルにそれぞれロードします。 その後、QX200 液滴生成装置 (Bio-Rad) によって液滴が生成され、96 ウェル PCR プレート (Eppendorf) に慎重に移されます。 サイクル条件は、95 °C で 10 分間、95 °C で 15 秒間および 57 °C で 1 分間を 40 サイクル、最終ステップは 98 °C で 10 分間です。 PCR 反応の最後に、液滴を QX200 液滴リーダーで読み取り、Quantasoft™ バージョン 1.7.4 ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して分析します。

利点: GH 反応性と相関する miRNA のパネルを確立することは、臨床応用性が非常に高く、GH 治療中に最良の反応を達成することを目的とした異なる治療プロトコルを必要とする患者を迅速に特定できるようになります。