miRNA som en vækstplademarkør efter GH

Introduktion Den kliniske erfaring med terapeutisk brug af rekombinant humant væksthormon (GH) har fundet tilstrækkelig vækstrespons hos størstedelen af ​​de patienter, der behandles for hver af de godkendte indikationer. Men efterhånden som erfaringerne akkumuleres med forskellige behandlingsregimer, blev det erkendt, at individuelle førsteårs højdereaktioner varierer betydeligt selv med individualiserede behandlingsregimer (1). Dårlig korttidsrespons oversættes også til en utilfredsstillende vækst i voksenhøjde (2).

Nogle matematiske modeller blev udviklet for at forudsige vækstrespons hos en individuel patient. Forudsigelsesmodeller afledt af den store Pfizer International Growth Database (KIGS)-database forklarer ca. 60 % af variabiliteten af ​​respons på GH-behandling hos patienter med GHD (3). Sådanne modeller tager højde for den definerbare variabilitet af respons, hvilket gør det muligt for klinikere at justere GH-dosis til den enkelte patient. Baseret på multiple regressionsanalyser har disse modeller identificeret faktorer, der korrelerer med vækst (hovedsageligt første års væksthastighed), såsom kronologisk alder, GH-top under provokerende tests, GH-dosis, fødselsvægt SDS, højde SDS justeret for målhøjde SDS ( 3). Biokemiske variabler såsom baseline IGF-I og leptin er også blevet tilføjet til forudsigelsesmodellerne.

Genetiske markører blev også brugt i et forsøg på at skelne mellem gode og dårlige respondere på GH-behandling, som exon 3-deleted væksthormon receptor polymorfisme, IGFBP3 polymorfisme og andre, men deres resultater var modstridende i de forskellige undersøgelser.

MikroRNA'er (miRNA'er) er små ikke-kodende RNA'er, der regulerer genekspression. De fleste gener i det menneskelige genom er reguleret af en eller flere miRNA'er (4). På grund af deres evne til at regulere genekspression, ser miRNA'er ud til at spille en vigtig rolle i patofysiologien og udviklingen af ​​fysiologiske processer såvel som i menneskelige sygdomme (5). MikroRNA'er undertrykker sædvanligvis genekspression ved at binde til 3'UTR-domænet af mRNA (6), hvilket øger mRNA-nedbrydning eller forhindrer translationel information og proteinsyntese.

En af de bemærkelsesværdige egenskaber ved miRNA'er er plasmacirkulationen inde i exosomer, der bestemmer dens modstandsdygtighed over for nedbrydning, tillader dens måling i det cirkulerende blod, og fungerer som en flydende biopsi (7).

Videnskabelige beviser i forskellige in vitro-modeller og i dyr antydede, at miRNA'er har en vigtig rolle i reguleringen af ​​endokondral ossifikation og i reguleringen af ​​hypothalamus-hypofyse-IGF-aksen (8). Især miRNA-140, 322 og 22 er blevet beskrevet som ansvarlige for vækstpladeudvikling (9). Catellani et al, viste, at miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p og miR -494-3p er involveret i reguleringen af ​​langsgående vækst og knogleudvikling gennem dets virkning på WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT og TGFβ signalveje (10).

Vækstrespons hos patienter under GH-behandling er variabel, afhængig af både patientens basale tilstande og individuel medfødt følsomhed over for terapi (11). Ofte er den målte vækstrate ikke sammenfaldende med den forventede, og graden af ​​korrelation mellem klinisk-auxologiske parametre og dosis og GH-top varierer enormt, både inter- og intra-individuelt under behandlingen (12).

Derfor er formålet med denne undersøgelse at måle de cirkulerende vækstpladesyntetiserede miRNA'er før og under GH-behandling, og søge efter dets korrelation med kliniske og biokemiske markører.

Metoder Børn og unge (n:30 patienter), begge køn, med GH-mangel (GHD) fulgt på den pædiatriske endokrinologiske enhed på Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasilien, vil blive screenet. Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere og deres forældre efter behov.

Inklusionskriterier: GH-stimuleringstest, der viser GH-peak-koncentration <5ng/ml, kombineret med magnetisk resonansbilleddannelse, der viser posterior hypofyse ektopisk kirtel (EPP). Patienter med kombineret hormonmangel skal kompenseres i undersøgelsesperioden.

Eksklusionskriterier: kroniske sygdomme, behov for forlængede suprafysiologiske doser af glukokortikoider, knoglealder >14 år eller >16 år (henholdsvis piger og drenge), patienter, der mangler tilstrækkelig opfølgning under undersøgelsesprotokollen.

Klinisk opfølgning: Kliniske optegnelser ved hvert besøg vil omfatte alder, vægt, højde, højde til målhøjdeforskel og pubertetsstadie. Klinisk evaluering vil blive taget på fem tidspunkter: før påbegyndelse af behandling (basal), og efter 1-, 3- og 6-måneders under GH-behandling. Body mass index (BMI) vil blive beregnet som vægt/højde² (kg/m²). Højde, målhøjde (TH) og BMI vil blive udtrykt som en SD-score (WHO, 2007). Væksthastighed SDS vil blive beregnet ved hjælp af Tanner reference (13). Puberteten i alle fag vil blive klassificeret efter Marshall og Tanners kriterier (14, 15). Knoglealderen vil blive opnået hver 6. måned og klassificeret i henhold til Greulich og Pyle (16).

Laboratorievurdering: Hormonmålinger vil blive målt efter 3 og 6 måneder og vil omfatte IGF-I, fastende glukose, insulin, TSH og fri T4; og kortisol. Gonadotropiner og kønssteroider vil blive målt, når det er tilstrækkeligt. For at evaluere ekspressionen af ​​vækstpladesyntetiserede miRNA'er, vil en basal blodprøve blive taget før start af GH-behandling eller efter en kort udvaskningsperiode (15-30 dage) og efter 1-, 3- og 6-måneder under GH-behandling.

MiRNA-bestemmelse: kvantitativ PCR (qPCR) vil blive brugt til at måle cirkulerende miRNA-niveauer ved at anvende den digitale dråbe-PCR (ddPCR), der anses for at være guldstandarden i anvendelsen af ​​flydende biopsi, fordi dens overlegne præcision og følsomhed er mindre påvirket af PCR-hæmmere og kræver ikke intern/ekstern normalisering, mens lav koncentration af målnukleinsyremolekyler detekteres. En fuldblodsprøve vil blive udtaget i vacutainer-serumseparatorrør og behandlet inden for 2 timer fra opsamling, centrifugeret ved 2.000 g i 10 minutter ved 4°C. Serum opdeles i 1,5 ml sterile RNase-frie rør og centrifugeres yderligere ved 2.500 g i 10 minutter ved 4°C for at fjerne forurenende celler og rester. Serum vil blive opsamlet i sterile RNase-fri rør og opbevaret ved -80°C indtil brug. Total RNA vil blive isoleret fra prøven ved hjælp af 200 ul serum ved hjælp af miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 - Qiagen).

Følgende miRNA'er vil blive målt: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p og miR-494-3p. For hver ddPCR-assay tilsættes 3 μL cDNA-prøve, 10 μL 2x ddPCR-supermix til prober (Bio-Rad), 1 μL 20x TaqMan miRNA-probe og 6 μL RNase-frit vand i en 20 μL reaktionsblanding. Derefter vil blandingen og 70 μL dråbegenereringsolie til prober (Bio-Rad) blive fyldt i henholdsvis prøvebrøndene og oliebrøndene på en engangsdråbegeneratorpatron (Bio-Rad). Derefter vil dråber blive genereret af QX200 dråbegeneratorenhed (Bio-Rad) og forsigtigt overført til en 96-brønds PCR-plade (Eppendorf). Cyklusbetingelserne vil være: 95 °C i 10 minutter, 40 cyklusser af 95 °C i 15 s og 57 °C i 1 minut, og et sidste trin ved 98 °C i 10 minutter. Ved afslutningen af ​​PCR-reaktionen vil dråber blive læst i QX200 dråbelæseren og analyseret ved hjælp af Quantasoft™ version 1.7.4 softwaren (Bio-Rad).

Fordele: Etablering af et panel af miRNA'er, der korrelerer med GH-respons er af enorm klinisk anvendelighed, hvilket muliggør hurtig identifikation af patienter, som har brug for differentielle terapeutiske protokoller, der er målrettet for at opnå den bedste respons under GH-behandling.