miRNA als Wachstumsplattenmarker nach GH

Einleitung Die klinische Erfahrung mit der therapeutischen Verwendung von rekombinantem menschlichem Wachstumshormon (GH) hat gezeigt, dass bei der Mehrzahl der Patienten, die für jede der zugelassenen Indikationen behandelt wurden, eine angemessene Wachstumsreaktion erzielt wurde. Da jedoch die Erfahrungen mit verschiedenen Behandlungsschemata gesammelt wurden, wurde erkannt, dass die individuellen Reaktionen auf die Körpergröße im ersten Jahr selbst bei individualisierten Behandlungsschemata erheblich variieren (1). Eine schlechte kurzfristige Reaktion führt auch zu einer unbefriedigenden Zunahme der Körpergröße im Erwachsenenalter (2).

Einige mathematische Modelle wurden entwickelt, um die Wachstumsreaktion einzelner Patienten vorherzusagen. Vorhersagemodelle, die aus der großen Datenbank Pfizer International Growth Database (KIGS) abgeleitet wurden, erklären etwa 60 % der Variabilität des Ansprechens auf die Wachstumshormontherapie bei Patienten mit Wachstumshormonen (3). Solche Modelle berücksichtigen die definierbare Variabilität der Reaktionsfähigkeit und ermöglichen es Ärzten, die GH-Dosis an den einzelnen Patienten anzupassen. Basierend auf mehreren Regressionsanalysen haben diese Modelle Faktoren identifiziert, die mit dem Wachstum korrelieren (hauptsächlich die Wachstumsgeschwindigkeit im ersten Jahr), wie z. B. chronologisches Alter, GH-Peak während Provokationstests, GH-Dosis, Geburtsgewicht-SDS, Körpergrößen-SDS angepasst an die Zielgröße-SDS ( 3). Den Vorhersagemodellen wurden auch biochemische Variablen wie der Basis-IGF-I und Leptin hinzugefügt.

Genetische Marker wurden ebenfalls verwendet, um zu unterscheiden, ob sie gut oder schlecht auf die Behandlung mit Wachstumshormonen ansprechen, beispielsweise der Exon-3-deletierte Wachstumshormonrezeptor-Polymorphismus, der IGFBP3-Polymorphismus und andere. Ihre Ergebnisse waren jedoch in den verschiedenen Studien widersprüchlich.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nichtkodierende RNAs, die die Genexpression regulieren. Die meisten Gene im menschlichen Genom werden durch eine oder mehrere miRNAs reguliert (4). Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Genexpression zu regulieren, scheinen miRNAs eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie und Entwicklung physiologischer Prozesse sowie bei menschlichen Krankheiten zu spielen (5). MicroRNAs unterdrücken normalerweise die Genexpression, indem sie an die 3'UTR-Domäne der mRNA binden (6), wodurch der mRNA-Abbau erhöht oder die Translationsinformation und die Proteinsynthese verhindert werden.

Eine der bemerkenswerten Eigenschaften von miRNAs ist die Plasmazirkulation innerhalb der Exosomen, die ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Abbau bestimmt und ihre Messung im zirkulierenden Blut ermöglicht, was als Flüssigkeitsbiopsie funktioniert (7).

Wissenschaftliche Erkenntnisse in verschiedenen In-vitro-Modellen und an Tieren legen nahe, dass miRNAs eine wichtige Rolle bei der Regulierung der endochondralen Ossifikation und bei der Regulierung der Hypothalamus-Hypophysen-IGF-Achse spielen (8). Insbesondere miRNA-140, 322 und 22 wurden als verantwortlich für die Entwicklung der Wachstumsfuge beschrieben (9). Catellani et al. zeigten, dass miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p und miR -494-3p ist durch seine Wirkung auf die Signalwege WNT-βcatenin, Notch, PI3K/AKT und TGFβ an der Regulierung des Längswachstums und der Knochenentwicklung beteiligt (10).

Die Wachstumsreaktion bei Patienten während der GH-Behandlung ist unterschiedlich und hängt sowohl von den Grundbedingungen des Patienten als auch von der individuellen angeborenen Empfindlichkeit gegenüber der Therapie ab (11). Häufig stimmt die gemessene Wachstumsrate nicht mit der erwarteten überein und der Grad der Korrelation zwischen klinisch-auxologischen Parametern sowie Dosis und GH-Peak variiert enorm, sowohl inter- als auch intraindividuell während der Behandlung (12).

Ziel dieser Studie ist es daher, die synthetisierten miRNAs der zirkulierenden Wachstumsplatte vor und während der GH-Behandlung zu messen und nach ihrer Korrelation mit klinischen und biochemischen Markern zu suchen.

Methoden Kinder und Jugendliche (n: 30 Patienten) beiderlei Geschlechts mit GH-Mangel (GHD), die in der Abteilung für pädiatrische Endokrinologie der Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasilien, beobachtet werden, werden untersucht. Eine schriftliche Einverständniserklärung wird von allen Teilnehmern und gegebenenfalls ihren Eltern eingeholt.

Einschlusskriterien: GH-Stimulationstest, der eine GH-Spitzenkonzentration <5 ng/ml zeigt, kombiniert mit einer Magnetresonanztomographie, die die hintere Hypophyse (EPP) zeigt. Patienten mit kombiniertem Hormonmangel müssen während des Studienzeitraums kompensiert werden.

Ausschlusskriterien: chronische Erkrankungen, Bedarf an längeren supraphysiologischen Dosen von Glukokortikoiden, Knochenalter > 14 Jahre bzw. > 16 Jahre (Mädchen bzw. Jungen), Patienten ohne angemessene Nachbeobachtung während des Studienprotokolls.

Klinische Nachuntersuchung: Zu den klinischen Aufzeichnungen bei jedem Besuch gehören Alter, Gewicht, Größe, Höhenunterschied zwischen Zielgröße und Pubertätsstadium. Die klinische Bewertung erfolgt zu fünf Zeitpunkten: vor Beginn der Therapie (basal) und nach 1, 3 und 6 Monaten während der GH-Behandlung. Der Body-Mass-Index (BMI) wird als Gewicht/Größe² (kg/m²) berechnet. Körpergröße, Zielgröße (TH) und BMI werden als SD-Score ausgedrückt (WHO, 2007). Die Wachstumsgeschwindigkeit SDS wird anhand der Tanner-Referenz (13) berechnet. Die Pubertät wird in allen Fächern nach den Kriterien von Marshall und Tanner klassifiziert (14, 15). Das Knochenalter wurde alle 6 Monate ermittelt und nach Greulich und Pyle (16) klassifiziert.

Laborbewertung: Hormonmessungen werden nach 3 und 6 Monaten gemessen und umfassen IGF-I, Nüchternglukose, Insulin, TSH und freies T4; und Cortisol. Gonadotropine und Sexualsteroide werden gemessen, sofern ausreichend. Um die Expression von wachstumsplattensynthetisierten miRNAs zu bewerten, wird vor Beginn der GH-Therapie oder nach einer kurzen Auswaschphase (15–30 Tage) und nach 1, 3 und 6 Monaten während der GH-Behandlung eine Basalblutprobe entnommen.

MiRNA-Bestimmung: Quantitative PCR (qPCR) wird zur Messung der zirkulierenden miRNA-Spiegel verwendet. Dabei kommt die digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR) zum Einsatz, die aufgrund ihrer überlegenen Präzision und Empfindlichkeit als Goldstandard bei der Anwendung der Flüssigbiopsie gilt und weniger beeinträchtigt wird durch PCR-Inhibitoren und erfordern keine interne/externe Normalisierung beim Nachweis niedriger Konzentrationen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen. Eine Vollblutprobe wird in Vacutainer-Serumtrennröhrchen entnommen und innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme verarbeitet und 10 Minuten lang bei 4 °C und 2.000 g zentrifugiert. Das Serum wird in 1,5-ml-sterile RNase-freie Röhrchen aliquotiert und 10 Minuten lang bei 4 °C und 2.500 g weiter zentrifugiert, um alle kontaminierenden Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Das Serum wird in sterilen RNase-freien Röhrchen gesammelt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Die Gesamt-RNA wird aus der Probe mit 200 µl Serum und dem miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 – Qiagen) isoliert.

Die folgenden miRNAs werden gemessen: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p und miR-494-3p. Für jeden ddPCR-Assay werden 3 μl cDNA-Probe, 10 μl 2× ddPCR-Supermix für Sonden (Bio-Rad), 1 μl 20× TaqMan miRNA-Sonde und 6 μl RNase-freies Wasser in eine 20 μl Reaktionsmischung gegeben. Anschließend werden die Mischung und 70 μl Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden (Bio-Rad) in die Probenvertiefungen und Ölvertiefungen einer Einweg-Tröpfchengeneratorkartusche (Bio-Rad) geladen. Danach werden Tröpfchen mit dem Tröpfchengeneratorgerät QX200 (Bio-Rad) erzeugt und vorsichtig auf eine 96-Well-PCR-Platte (Eppendorf) übertragen. Die Zyklusbedingungen sind: 95 °C für 10 Minuten, 40 Zyklen mit 95 °C für 15 Sekunden und 57 °C für 1 Minute und ein letzter Schritt bei 98 °C für 10 Minuten. Am Ende der PCR-Reaktion werden die Tröpfchen im Tröpfchenlesegerät QX200 gelesen und mit der Software Quantasoft™ Version 1.7.4 (Bio-Rad) analysiert.

Vorteile: Die Etablierung eines Panels von miRNAs, die mit der GH-Reaktionsfähigkeit korrelieren, ist von enormer klinischer Anwendbarkeit und ermöglicht die schnelle Identifizierung von Patienten, die gezielte differenzielle Therapieprotokolle benötigen, um die beste Reaktion während der GH-Behandlung zu erreichen.