miRNA como marcador de placa de crecimiento después de GH

Introducción La experiencia clínica con el uso terapéutico de la hormona de crecimiento humana recombinante (GH) ha encontrado una adecuada respuesta de crecimiento en la mayoría de los pacientes tratados para cada una de las indicaciones aprobadas. Sin embargo, a medida que se acumula la experiencia con diferentes regímenes de tratamiento, se reconoció que las respuestas individuales de altura en el primer año varían considerablemente incluso con regímenes de tratamiento individualizados (1). La mala respuesta a corto plazo también se traduce en una ganancia insatisfactoria en la talla adulta (2).

Se desarrollaron algunos modelos matemáticos para predecir la respuesta de crecimiento de un paciente individual. Los modelos de predicción derivados de la gran base de datos de Pfizer International Growth Database (KIGS) explican aproximadamente el 60 % de la variabilidad de la respuesta a la terapia con GH en pacientes con GHD (3). Dichos modelos dan cuenta de la variabilidad definible de la capacidad de respuesta, lo que permite a los médicos ajustar la dosis de GH al paciente individual. Con base en análisis de regresión múltiple, estos modelos han identificado factores que se correlacionan con el crecimiento (principalmente la velocidad de crecimiento del primer año), como la edad cronológica, el pico de GH durante las pruebas de provocación, la dosis de GH, el SDS del peso al nacer, el SDS de la altura ajustado para el SDS de la altura objetivo ( 3). También se han agregado a los modelos de predicción variables bioquímicas como el IGF-I de referencia y la leptina.

También se utilizaron marcadores genéticos en un intento de discriminar buenos y malos respondedores al tratamiento con GH, como el polimorfismo del receptor de la hormona del crecimiento con deleción del exón 3, el polimorfismo IGFBP3 y otros, pero sus resultados fueron contradictorios en los diferentes estudios.

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica. La mayoría de los genes del genoma humano están regulados por uno o más miARN (4). Debido a su capacidad para regular la expresión génica, los miARN parecen jugar un papel importante en la fisiopatología y desarrollo de procesos fisiológicos, así como en enfermedades humanas (5). Los microARN generalmente suprimen la expresión génica al unirse al dominio 3'UTR del ARNm (6), por lo tanto, aumentan la degradación del ARNm o evitan la información de traducción y la síntesis de proteínas.

Una de las características destacables de los miRNAs es la circulación del plasma dentro de los exosomas, determinando su resistencia a la degradación, permitiendo su medición en la sangre circulante, actuando como una biopsia líquida (7).

La evidencia científica en diferentes modelos in vitro y en animales, sugirió que los miRNAs tienen un papel importante en la regulación de la osificación endocondral y en la regulación del eje hipotalámico-pituitario-IGF (8). En particular, los miRNA-140, 322 y 22 se han descrito como responsables del desarrollo de la placa de crecimiento (9). Catellani et al demostraron que miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p y miR -494-3p están involucrados en la regulación del crecimiento longitudinal y desarrollo óseo, a través de su acción sobre las vías de señalización WNT-βcatenina, Notch, PI3K/AKT y TGFβ (10).

La respuesta de crecimiento en pacientes durante el tratamiento con GH es variable, dependiendo tanto de las condiciones basales del paciente como de la sensibilidad innata individual a la terapia (11). A menudo, la tasa de crecimiento medida no coincide con la esperada y el grado de correlación entre los parámetros clínico-auxológicos y la dosis y el pico de GH varían enormemente, tanto inter como intraindividualmente durante el tratamiento (12).

Por tanto, el objetivo de este estudio es medir los miRNAs sintetizados en la placa de crecimiento circulante antes y durante el tratamiento con GH, buscando su correlación con marcadores clínicos y bioquímicos.

Métodos Serán tamizados niños y adolescentes (n:30 pacientes), de ambos sexos, con deficiencia de GH (GHD) seguidos en la Unidad de Endocrinología Pediátrica de la Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brasil. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de todos los participantes y sus padres, según corresponda.

Criterios de inclusión: prueba de estimulación de GH que muestra una concentración máxima de GH <5 ng/ml, combinada con resonancia magnética que muestra glándula pituitaria ectópica posterior (EPP). Los pacientes con deficiencias hormonales combinadas deben ser compensados ​​durante el período de estudio.

Criterios de exclusión: enfermedades crónicas, necesidad de dosis suprafisiológicas prolongadas de glucocorticoides, edad ósea > 14 años o > 16 años (niñas y niños, respectivamente), pacientes sin seguimiento adecuado durante el protocolo del estudio.

Seguimiento clínico: Las historias clínicas en cada visita incluirán la edad, el peso, la altura, la diferencia de altura para alcanzar el objetivo y la etapa puberal. La evaluación clínica se realizará en cinco momentos: antes de comenzar la terapia (basal) y después de 1, 3 y 6 meses durante el tratamiento con GH. El índice de masa corporal (IMC) se calculará como peso/altura² (kg/m²). La altura, la altura objetivo (TH) y el IMC se expresarán como una puntuación SD (OMS, 2007). La velocidad de crecimiento SDS se calculará utilizando la referencia de Tanner (13). La pubertad en todos los sujetos se clasificará siguiendo los criterios de Marshall y Tanner (14, 15). La edad ósea se obtendrá cada 6 meses y se clasificará según Greulich y Pyle (16).

Evaluación de laboratorio: las mediciones hormonales se medirán a los 3 y 6 meses e incluirán IGF-I, glucosa en ayunas, insulina, TSH y T4 libre; y cortisol. Las gonadotropinas y los esteroides sexuales se medirán cuando sea adecuado. Para evaluar la expresión de los miARN sintetizados en la placa de crecimiento, se obtendrá una muestra de sangre basal antes de comenzar la terapia con GH o después de un período de lavado breve (15 a 30 días) y después de 1, 3 y 6 meses durante el tratamiento con GH.

Determinación de miRNAs: se utilizará la PCR cuantitativa (qPCR) para medir los niveles de miRNA circulantes, mediante el empleo de la PCR digital de gotitas (ddPCR), considerada el estándar de oro en la aplicación de la biopsia líquida, debido a su mayor precisión y sensibilidad, viéndose menos afectada por inhibidores de PCR, y no requieren normalización interna/externa mientras detectan una baja concentración de moléculas de ácidos nucleicos diana. Se extraerá una muestra de sangre completa en tubos separadores de suero vacutainer y se procesará dentro de las 2 h posteriores a la recolección, se centrifugará a 2000 g durante 10 min a 4 °C. El suero se dividirá en alícuotas en tubos estériles sin ARNasa de 1,5 ml y se centrifugará a 2500 g durante 10 min a 4 °C para eliminar las células y los desechos contaminantes. El suero se recogerá en tubos estériles sin ARNasa y se almacenará a -80 °C hasta su uso. El ARN total se aislará de la muestra usando 200 ul de suero usando el kit avanzado de suero/plasma miRNeasy (ID: 217204 - Qiagen).

Se medirán los siguientes miARN: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p y miR-494-3p. Para cada ensayo de ddPCR, se agregarán 3 μL de muestra de ADNc, 10 μL de supermezcla de ddPCR 2x para sondas (Bio-Rad), 1 μL de sonda de miARN TaqMan 20x y 6 μL de agua sin ARNasa en una mezcla de reacción de 20 μL. Luego, la mezcla y 70 μL de aceite de generación de gotas para sondas (Bio-Rad) se cargarán respectivamente en los pozos de muestra y pozos de aceite de un cartucho generador de gotas desechable (Bio-Rad). Después de eso, las gotas serán generadas por el dispositivo generador de gotas QX200 (Bio-Rad) y transferidas cuidadosamente a una placa de PCR de 96 pocillos (Eppendorf). Las condiciones de ciclado serán: 95 °C por 10 min, 40 ciclos de 95 °C por 15 s y 57 °C por 1 min, y un paso final a 98 °C por 10 min. Al final de la reacción de PCR, las gotas se leerán en el lector de gotas QX200 y se analizarán con el software Quantasoft™ versión 1.7.4 (Bio-Rad).

Beneficios: establecer un panel de miARN que se correlacione con la capacidad de respuesta de la GH tiene una gran aplicabilidad clínica, lo que permite la identificación rápida de pacientes que necesitan protocolos terapéuticos diferenciales dirigidos a lograr la mejor respuesta durante el tratamiento con GH.