miRNA als groeiplaatmarker na GH

Inleiding Uit de klinische ervaring met het therapeutisch gebruik van recombinant humaan groeihormoon (GH) is gebleken dat de meeste patiënten die voor elk van de goedgekeurde indicaties worden behandeld, een adequate groeirespons hebben. Naarmate de ervaring zich opstapelt met verschillende behandelingsregimes, werd echter erkend dat individuele lengteresponsen in het eerste jaar aanzienlijk variëren, zelfs met geïndividualiseerde behandelingsregimes (1). Een slechte kortetermijnrespons vertaalt zich ook in een onbevredigende toename van de volwassen lengte (2).

Er zijn enkele wiskundige modellen ontwikkeld om de groeirespons van een individuele patiënt te voorspellen. Voorspellingsmodellen afgeleid van de grote Pfizer International Growth Database (KIGS) database verklaren ongeveer 60% van de variabiliteit van respons op GH-therapie bij patiënten met GHD (3). Dergelijke modellen verklaren de definieerbare variabiliteit van responsiviteit, waardoor clinici de GH-dosis kunnen aanpassen aan de individuele patiënt. Op basis van meerdere regressieanalyses hebben deze modellen factoren geïdentificeerd die correleren met groei (voornamelijk groeisnelheid in het eerste jaar), zoals chronologische leeftijd, GH-piek tijdens provocerende tests, GH-dosis, geboortegewicht SDS, lengte SDS aangepast voor streeflengte SDS ( 3). Biochemische variabelen zoals de basislijn IGF-I en leptine zijn ook toegevoegd aan de voorspellingsmodellen.

Genetische markers werden ook gebruikt in een poging om onderscheid te maken tussen goede en slechte responders op GH-behandeling, zoals het exon 3-gedeleteerde groeihormoonreceptorpolymorfisme, IGFBP3-polymorfisme en andere, maar hun resultaten waren tegenstrijdig in de verschillende onderzoeken.

MicroRNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende RNA's die genexpressie reguleren. De meeste genen in het menselijk genoom worden gereguleerd door een of meer miRNA's (4). Vanwege hun vermogen om genexpressie te reguleren, lijken miRNA's een belangrijke rol te spelen in de pathofysiologie en ontwikkeling van fysiologische processen, evenals in ziekten bij de mens (5). MicroRNA's onderdrukken gewoonlijk genexpressie door te binden aan het 3'UTR-domein van mRNA (6), waardoor de afbraak van mRNA toeneemt of translationele informatie en eiwitsynthese worden voorkomen.

Een van de opmerkelijke kenmerken van miRNA's is de plasmacirculatie in exosomen, die de weerstand tegen afbraak bepaalt, waardoor de meting ervan in het circulerende bloed mogelijk wordt, en die werkt als een vloeibare biopsie (7).

Wetenschappelijk bewijs in verschillende in-vitro-modellen en bij dieren suggereerde dat miRNA's een belangrijke rol spelen bij de regulatie van endochondrale ossificatie en bij de regulatie van de hypothalamus-hypofyse-IGF-as (8). Met name miRNA-140, 322 en 22 zijn beschreven als verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de groeischijf (9). Catellani et al toonden aan dat miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p en miR -494-3p is betrokken bij de regulatie van longitudinale groei en botontwikkeling, door zijn werking op WNT-βcatenine, Notch, PI3K/AKT en TGFβ signaalroutes (10).

De groeirespons bij patiënten tijdens de GH-behandeling is variabel, zowel afhankelijk van de basale toestand van de patiënt als van de individuele aangeboren gevoeligheid voor therapie (11). Vaak valt de gemeten groeisnelheid niet samen met de verwachte en varieert de mate van correlatie tussen klinisch-auxologische parameters en dosis en GH-piek enorm, zowel inter- als intra-individueel tijdens de behandeling (12).

Daarom is het doel van deze studie om de circulerende groeischijf gesynthetiseerde miRNA's te meten voor en tijdens de GH-behandeling, op zoek naar de correlatie met klinische en biochemische markers.

Methoden Kinderen en adolescenten (n:30 patiënten), beide geslachten, met GH-deficiëntie (GHD) die worden gevolgd op de afdeling Pediatrische Endocrinologie van de Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, Brazilië, zullen worden gescreend. Schriftelijke geïnformeerde toestemming zal worden verkregen van alle deelnemers en hun ouders, indien van toepassing.

Inclusiecriteria: GH-stimulatietest die GH-piekconcentratie <5ng/ml laat zien, gecombineerd met magnetische resonantiebeeldvorming die posterieure hypofyse-ectopische klier (EPP) laat zien. Patiënten met gecombineerde hormoondeficiënties moeten gedurende de onderzoeksperiode worden gecompenseerd.

Uitsluitingscriteria: chronische ziekten, behoefte aan langdurige suprafysiologische doses glucocorticoïden, botleeftijd >14 jaar of >16 jaar (respectievelijk meisjes en jongens), patiënten bij wie adequate follow-up ontbreekt tijdens het onderzoeksprotocol.

Klinische follow-up: Klinische gegevens bij elk bezoek omvatten leeftijd, gewicht, lengte, lengte tot streefhoogteverschil en puberteitsstadium. Klinische evaluatie vindt plaats op vijf tijdstippen: vóór aanvang van de therapie (basaal) en na 1, 3 en 6 maanden tijdens de GH-behandeling. De body mass index (BMI) wordt berekend als gewicht/lengte² (kg/m²). Lengte, streeflengte (TH) en BMI worden uitgedrukt als een SD-score (WHO, 2007). De groeisnelheid SDS wordt berekend met behulp van Tanner-referentie (13). De puberteit zal bij alle proefpersonen worden geclassificeerd volgens de criteria van Marshall en Tanner (14, 15). De botleeftijd wordt elke 6 maanden bepaald en geclassificeerd volgens Greulich en Pyle (16).

Laboratoriumbeoordeling: Hormoonmetingen worden gemeten na 3 en 6 maanden en omvatten IGF-I, nuchtere glucose, insuline, TSH en vrij T4; en cortisol. Gonadotropines en geslachtshormonen worden gemeten wanneer ze voldoende zijn. Om de expressie van door de groeischijf gesynthetiseerde miRNA's te evalueren, zal een basaal bloedmonster worden verkregen voordat de GH-therapie wordt gestart of na een korte uitwasperiode (15-30 dagen) en na 1, 3 en 6 maanden tijdens de GH-behandeling.

MiRNAs-bepaling: kwantitatieve PCR (qPCR) zal worden gebruikt om circulerende miRNA-niveaus te meten, door gebruik te maken van de druppel digitale PCR (ddPCR), die wordt beschouwd als de gouden standaard bij de toepassing van vloeibare biopsie, omdat de superieure precisie en gevoeligheid ervan minder wordt beïnvloed door PCR-remmers, en vereisen geen interne/externe normalisatie bij het detecteren van lage concentraties doelnucleïnezuurmoleculen. Er wordt een volbloedmonster afgenomen in vacutainer-serumscheiderbuizen, en binnen 2 uur na afname verwerkt, gecentrifugeerd bij 2.000 g gedurende 10 minuten bij 4°C. Serum wordt verdeeld in steriele RNase-vrije buisjes van 1,5 ml en verder gecentrifugeerd bij 2.500 g gedurende 10 minuten bij 4°C om alle verontreinigende cellen en afval te verwijderen. Serum wordt verzameld in steriele RNase-vrije buisjes en tot gebruik bewaard bij -80°C. Totaal RNA zal worden geïsoleerd uit het monster met behulp van 200 µl serum met behulp van de miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (ID: 217204 - Qiagen).

De volgende miRNA's worden gemeten: miR-22-3p, miR-30c-5p, miR-106a-5p, miR-140-5p, miR-199a-5p, miR-335-5p, miR-340-5p en miR-494-3p. Voor elke ddPCR-assay worden 3 µl cDNA-monster, 10 µl 2× ddPCR-supermix voor sondes (Bio-Rad), 1 µl 20× TaqMan miRNA-probe en 6 µl RNase-vrij water toegevoegd in een reactiemengsel van 20 µl. Vervolgens worden het mengsel en 70 μL druppelvormingsolie voor sondes (Bio-Rad) respectievelijk geladen in de monsterputten en olieputten van een wegwerpbare druppelgeneratorpatroon (Bio-Rad). Daarna worden druppeltjes gegenereerd door het QX200-druppelgeneratorapparaat (Bio-Rad) en voorzichtig overgebracht naar een PCR-plaat met 96 putjes (Eppendorf). De fietsomstandigheden zijn: 95 °C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 15 seconden en 57 °C gedurende 1 minuut, en een laatste stap bij 98 °C gedurende 10 minuten. Aan het einde van de PCR-reactie worden de druppels gelezen in de QX200-druppellezer en geanalyseerd met behulp van de Quantasoft™ versie 1.7.4-software (Bio-Rad).

Voordelen: Het opzetten van een panel van miRNA's dat correleert met GH-responsiviteit is van enorme klinische toepasbaarheid, waardoor snelle identificatie van patiënten mogelijk is die differentiële therapeutische protocollen nodig hebben die gericht zijn op het bereiken van de beste respons tijdens GH-behandeling.